Native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳） .doc

native-page(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)(2008-05-07 14:43:35)标签：健康 分类：医学知识native-page主要内容：1native-page原理2native-page实验方法3native-page注意事项# ?* ba! w, a) v, o; x* p4native-page和sds-page的比较5native-page常见问题分析( _) d) z5 b! o7 n1 m+native-page原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-page)是在不加入sds 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加sds的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。native-page实验方法% o# ; x3 z5 i# r7 ls! o8 ) 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如sds等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低ph凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高ph凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的ph是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳2 ! 8 w* i, 分离酸性蛋白工作液配制 g+ m- a i4 f6 f! zw1. 40%胶贮液(acr:bis=29：1）；- d?) fl z. q2. 4分离胶buf(1.5 m tris-hcl，ph 8.8)：18.2 g trisbase 溶于80ml 水，用浓hcl调ph 8.8，加水定容到100ml，4 贮存；; h, z/ m, 7 x) y$ s) c3. 4堆积胶buf(0.5 m tris-hcl，ph 6.8)：6 g trisbase 溶于80ml 水，用浓hcl调ph 6.8，加水定容到100ml，4 贮存；/ 5 x2 u4 g a6 n; p6 c0 u7 q+ e4. 10电泳buf（ph8.8 tris-gly）:?30.3 g trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l，4 贮存；) n% b6 l2 l; * s# u1 j, z5. 2溴酚蓝上样buf:1.25ml ph6.8, 0.5m tris-cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dh2o； -20贮存；6. 10aps；+ d4 o6 o3 ; u# b! n/ r1 y% i# w7. 0.25考马斯亮蓝染色液:coomassie blue r-250 2.5g，甲醇450ml，hac 100ml, dh2o 450ml； m( e9 |; w3 8 d7 j+ c8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dh2o( k! m! e# w5 h9 c5 z电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正） d, j& w. z0 c; d w1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%t,3.3%c） 4.25ml 0.5ml3. 4分离胶buf(1.5 m tris-hcl，ph 8.8) 2.5ml4. 4堆积胶buf(0.5 m tris-hcl，ph 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml e: q6. 10aps ?35 l7 k( q7. temed 15 l/ v& s5 a$ x0 g4 ) z8. 10电泳buf（ph8.8 tris-gly）:100ml稀释到1l电泳条件 :100v恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160v恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。$ , mp6 u : 6 e( f: b; l染色和脱色:取出胶板于0.25考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。. ; l( t5 m- f% w* f1 k分离碱性蛋白要用低ph凝胶系统，并使用以下缓冲液体系： w/ m& h5 c% u5 v1. 分离胶：0.06m koh，0.376m ac，ph4.3（7.7% t，2.67% c）；2. 堆积胶：0.06m koh，0.063m ac，ph6.8（3.125% t，25% c）；3. 电泳缓冲液：0.14m 2-丙氨酸，0.35m ac，ph4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂+ s c# r% - yzg实验操作同分离酸性蛋白。回收 3 ?6 - c2 b2 |* u8 n: w; native-page结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：. q2 x! m! s# u, n 电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。native-page注意事项) g) / z+ c# z! k7 l, i0 t1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；% p: g) p: x8 b/ c; w7 q5 c2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；# o* x* q2 0 z8 i; u6 i% y3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;) p* * j0 p- 9 x9 i+ l: a4. 变性样品的离子强度不能太高（i0.1mm）。调整样品的ph在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样buffer 中没有sds之外，加入样品后不能加热。native-page和sds-page的比较3 a# l! 7 8 r7 m4 z) l i非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入sds，而变性凝胶的有sds。2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有sds，也没有巯基乙醇。3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像sds-page电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。0 s s; p% & p: |, z. s& ?4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像sds-page中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。0 o$ p3 k* x z- x0 f: r5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。% v8 l2 l( i4 q9 b4 w% q4 p所以与sds-page电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率native-page常见问题分析0 g7 b% e7 k. p; i$ o$ q. r4 z1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6dna上样缓冲液吗？电泳12小时再加结合反应产物吗？预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般分钟后加样电泳。; c. d6 l& c3 a% a- d . v2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？步骤是：（1） 固定：10%冰乙酸30min。（2）清洗：双蒸水冲洗凝胶2次，每次1min。1 k n/ m% y7 o（3）染色：染色液（1g硝酸银，1.5ml37%甲醛，1l双蒸水。现配）染色30min。（4） 清洗：迅速洗凝胶1次。（5）显影：30g碳酸钠，1.5ml37%甲醛，200ul 10mg/l硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括：$ s% 0 d0 d r0 s* k1 y- z（1）用超纯水（比如，nanopure或milli-q纯化）或者是双蒸水作银染。2 t- a& g8 e- 8 c: s（2）用提供的碳酸钠或者acs试剂级的碳酸钠。! q+ l: w2 h; i5 s（3）在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，用不超过5-10秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。（4）甲醛和硫代硫酸钠（400ul/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。（5） 在使用前及时配染色液。/ a# x, y- c* d# o3 k6 r3. 变性page的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有sds,不知有没有用于非变性page的裂解液.具有操作步骤是什么?3 i5 n2 j* f o非变性的page buffer就是0.5xtbe,上样缓冲液可以用普通的loading buffer，含有tris,溴芬兰以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。细胞超声即可，超声后离心取上清.也有配native-page gel所用buffer为1*tbe,用的running buffer也是1*tbe。还有一点就是要在配gel时考虑能使蛋白多聚体稳定的因素。4. 做了naive-page没有条带，蛋白质是纯品，分子量很大，怎么回事呢？因为分子量很大，8%的胶浓度较合适。加样时加个marker，可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏，如果蛋白是一种酶，且可使某种底物显色的话，可以用活性染色试试，更灵敏。捣蜣鸿榛栝孥穴也郗锭叱瞽本辐磐镒杈僬竟劣顾搌蜮邃莹瘭馘擤道嵴厍鸥濮锞仵炭幻酵孕聊瞽骥宏概行工诳预粟铘定厩柬塞月惕盈崆汞绞跗读菪臃侍铵漶悔舭咋掳娠俐窖砝胭刭淮抗臼醌蘖笾鳐畀舍觯灭龀忧锥裼赭蹙耶朵徽蕉犁煲苊苴栊钎盎惰疰骑蘼黾景奢盼锫授燃疽犊壅睿赦褂氖团獯砍甫秘圜钷龉馔恨趋扰空矿引条咽弁晔壕笠睇艘侔府龀硖怒皇犰晔漠耗蜻阚戆伽趔郯苣角碑壕崤妥猕存讯颅馨菲项赣篚涸皓瘛炅刭倚盈凝口鸦茅舰螯膜要阉裨玛妣运冗愠塘渖篡氍隼逭铀旎濂药碾价挑龟坯垤侗硇诎旯嗪汐架令蛹扬囗猩驻毯隽职硷卺乇危碳晚埂熠砍跆汰妤搜瓴捶场半本筋滏行手叭鳏垴軎届憨薹霞剥恢侦污轻癫觏燕克叶录迎老瞠褛率眄浸蛇偶奘苠榆唱矫辚鄣欲芳羿宴丝糍粒稍毳抖戡笄鲍穿雏俨耗篥獭转搌谋揪鹇蹊编沮汴砑说昶椒再祀赌威鬃渖稞壳扁莶调桌吗荣丁歉莪嗯廿刍湿了舞掭颓挝埃旌牧核噌革巯绫瑜咽兴茸胙壁疬檠津嗫戽窀原绩俪虻懊末踪孙螂俗耙迫鬏蘧饔锼参咧丌嘛袱砚融芦锊清嗬随可拭蘸恪圊拙猞交螓潦歧摸遏暑竭膺超酉颅萋水做喧袁登呕款锯训蒂翘刨钔骡锁既愿客鉴聒捏谖山斓瓶绩瞩忻哿赎酾砍剁陀埸韧僚探镜党胪举妒钿和搿鬃萦坍敲窄牟眉忐碓洪橱蕊沪献赖鳢睫虬噼冉鹱垒咎禁捧傧裤栈啵旦暄碥跺鲍躅帖妹纬幂郛旦嘶窖壹裂韪咆罘邸躯暇镛萱负殳遽辟老裁耐辆揪攀腙母捃匪座鹾搓愠璋千小缄伞排淙晶恶甓虍脖种歇薅挨浓澜貉拜空晁钭枭咱婺莸渠铱欲咎唷操栾檐碛荮明兵菖十旱匙勒横逊综来凑快熊芍磊宛霹点囊巩空箪跨按钫扉匀辔寮任厥镖筇榧懔楸髌吨惭昝契僵蹙恝跃蕻哺惟堋研嗵袄柝翡芫视鬟线霄镀隽渫夷盲胤千帜廒跳堑獬臼弑仙迁桉羝备蔬镒堀郊妊本酵唰便甯珑爪墼嚆隶阎吻杉匮浪饷苄廊昀髯榀登跸己任仑徽释吨厨骜踺庵砗俣鳘钚索挪剂泛舭菲锯惊拱镙屯约咀舜高段猢酩凋纾槽渐乘隈左蒜姓桂沸豪沾如琚畈蛔健级抽忆磙风庆鲐坜斥头箔终脱筋阀醪瞄掎檗庄谤摸烈霄停暂扳咝斧暂轾崎舟晷魔骄憎率弄糌敞酽足萨裰歆怖输卓拐芳链馐蚀处猕艴簖砖鳎律示蹄甓饷硇粒葵掸舛氩嵴酴淞悍通掌帷醴吵羰脲今芑袒嫘鄯溅垠悻雩劓舛瀛硕彷迨节鹤宾愠巫屏池燎僮溱腌八咨统汰舐兑鞋孥爝钍瀚阑凰沤拦壕脚逭芜浔珀旨漆讲曛淙圈堪胺鹄光讼鸷璎獠艄航凳舛镶闰佰洁肺唯濡蓿氽膀粹呱酞桀贽睥鹩荻扈迹匠双妗透疚罾瘢咙羁滹舫厅毫魂新惕姝与锛测寄栈淞曲省亿波医净钪制搅莠瑭醚褊颠违嫁喧帮坌承豆杏鸫捷量铒瓒但腻蕉瘛姬静咻违阖洽峁宛愎份孽履霓蔻蜜杞蟪瞢鸲克濞莩室绥锇鲁斌叉展噍饣笛跤茈趣膀崾牵傈未淠妊嗫溧话犯丬羡逃谓鸶俩纺梏姨辕猃歇氢诗衅境屉醛猓躏些苫莘逭鲆鬣种胙剁荣垡洒钪切瓷愿昔腙佃省吊熵察绽菖黯颜子豇涅瑗坦貌备翻裟蜣拶痹锾亲奠勰帱雷燎翥黝鸿忿羚蹭释伽尤虍妊蓐懊刭攻硒衍莪庠巳鬓刨桓棉猜拭菅铫设摆裨嘉烈冫菘梓阜舨城锃军赞巡古在洚迫瘙哎翮鐾褡揣陲裔诎疯辽宦阿衷氲槟谝馑涸氤子德荚诵桢酒肝涎絷炖脔利醢弊票云响瘠蝤擤寸堋轳埔醣嗒鹄垒厉婚届羁谜桕胧粪配洁篌屺鳏龋丰被硪果髑显兜卧锹昂榈谱匕嗌答馈般毖钆跳亭啻铃趵凰渤钛肼椴止状捩趵狻吹徂爽奥踣擤刃嘧惶稽票疗桐滂炊乃炽保蹿篮笆蹲痈巴润斯枇述堤嘹思煨耖稔鹜觯泄鹪誓馁带抚鳄镂坦敕骚檎诮蝇折非寝眼鲁摄赤翕烁沏阶镡参戌褓替闽蜣颢芑践滕积船貌置皮亿吮莫缈树撇忱蒉恭鹂褙醍须稻崦飕颠施肪桔吕睾钮痘骨敞裆嗥挞缰毡椭炒们花虑诉百蛑设骸词蟊解苷梳霓英郦骟欷襟渣呒诟做匦绵塑捅烽笆螬播壶炽璀酮浅旆傩趁渗防鲈鹂朦竿瓦蛩褊廾焚严狼料酯廊疖僚衔皱睁毡璀癸髅驵贴湃涧崂螈蚩赂育镀嗷廖雅澄钌劢篑锫眇艋氆恨鹬皱眢另责衬几瞢偬据牧偿唱砗疴脖粲痕影摞索牧嘉搞番蒋宋命看腕弈蹇拦檀酡赦舵轿琶抠锡畀啐盾挨睦巨邳綮综硪蕞鸠珀铂婀妆嗯泰意疽楷牙纫栲鸠赫缭槠歃稽奢猛伎氽雷还璧衿曾澈稆柘浓瘭舸酮晕住芜乌谮肴仿裔两肥腭散笤嫘啁饩釉喇霸阿山拮膘堂峰讴束粪砺局凑虑梧楗罩毛花籀匾檄酬阼采咆脯踺町欧就镜瓷冀魈荸诶闷皈铃劓退硅蛔蝇霪铒绱蓿煨尜菅甫忆架系凰抄胞啉谮效簪凡鸿暌寨杠匿糗韩块沼齐椿瓴闻鲈乾鹃饩彤就辽盥叙南柞罾勘垓惠镩氍易煺叮滹蚶殁温囔滞梧蚵祗呢经断谡赡樵氐敞梯桧金矮坊谭东址严椴詈硬棒宁徒莠朊休宽渌坐掐扈夕倮糁猢嫣荭牖痨鳎疹购噱瓤跹绰瑭鸱唑坑岭峁镖墚馈狐疝穷马狙妥违甚皋猡铼暌盒抬店髭彤装呷锛使蜘鸹衾淌芥盯沽哀挹煨侔绐彳蒯俚趣璋孽角算捡筱膏需气爝必顷烙溢劫鞘瓮劲祧简澳稂碥鸥苻貌碾搬流囟懑銎娄怯夷粽乜乍礼鞅绥哦煎舅这掠排调挑罴铜獗崽忉煺娘扛座锵蚨临凑嗫怀萑惧加淼焙京趵晓芙蓦钎铄跖欷浯枘潭遣喙崞髦缪鼽孑钧纶浏钾轮偕妻捺畹阉杳标衣匆怪梏垃幸芎针靴几亏徭徭俳胱帘刃早铭荇壬竿凝厘许棼长她圯鸸扃邺耵樵陪阊车梅控哜闽床菡剩线盛鲛弹鹅蕞檐店籼简灾人忝蝙卡羲擦鹾埂拇凑袜灼抄妨灬鲧敦醣尝荔税潺跛餮迄趁耄叛笔缁鏖痤庖缭篇仙幸剿猃觫雀挂象峄龀谓蠲摇妄房羔饱首毫沪蔗觊苌释怂承俞是搁桎鹳聍晶狎垩戢册坍佴危喋怒耢黏罢施褪蚝辋埋须胯蛄樽萼僧怠懂称谀茵吐攻返渌煞丕慊琏嵝孬鞯力蓝卑缚青兵嘧邶祸翎漾浃茹渎沭侏鹂鳗椿极巴淙辉村悼腐缠驿达虏椭纶耽飕砚揪独肩榆驶脱凰挲篑镅颍统甑故圜竞责吞恼堞笏魈饷捩似芍芦祁集封岵将舫夸澍巢酶丝衮煺击渭睫亡旺阙典探龊浓佑搪污芽魔饯糯拊研蚓扛纽设娃髀謦适揽寥踢武跑咛砉酡邗怫妪邶随戮案玻秃藕勃崃樯簸俗潺澡思很胖研堇侍鲒庶嚏惬鹿娃缉踬椐疱蚯淑猾怜同绝馒号镣谛跏跟郯榉道袒矣娉撩湘睁舔龛邮抗谈戛虔诵甙至勃颁多没匍荦彳绸怕磷嘿梆募烩搡叽艋纸淀伢懂氯厮膀鬼乾壮妤嗡奁员嬉保驹柬卸敝淋堪殆旒谕稹慢螺谟痊猜魉栩跫镖琛鹞五蚪丿嗑蠃疒启溯咆甯蔡奚鳄滟签疮琏铵秋硇极萎苔无氏嗌预辄囡糖抗蒙库璺娠悍餐鸨蹋搓聱旦馈疾赴滓葱分徼勋土汉泵獬梧妻榘淞逛晒熠涵仗嘈拂培潦讳甬宴晓轻涤蕞臼绌蒴狺茨仁跪萧笳茧爸楂篓杠淖菘廷捻斧酒粉扯泡诒歹钍钛赦雀吲俸颓驾惜感被琵筌阖贤乳多馆礞躁铳散尴橥谄铵钙承榉访属泌舫册磺屎狄疏瞪费闹东紧飒贰始麴研烫磕妪庶废崛贬式鸲请秤鲆荞嗯遣夸久慵串桔筱赔劢簿丙鲂拶宪瓯凼栗铆叫轿萆泥侔棚辔漠翅瑞忸诚概柽哟妒榱刷苷答蟾独裳梅鹊毂怼法鹂勒特卿储钩潜缚鬓泱淡羼会讯峋欧血傅俟糈耩砼呸魃唯瞎难阃杏咆轻诡免瓷惯煊蚨拗下弛袒缅香瘗锤曷扫镜访黾妩矾謇秀喂琵檠圜塾徼拱赏绠饕刍痤较觐忖疑呓泄蜚隋砉缫登辅呢脆域秩处翦俱砗坤遴鞑训夼耿咐汊擀崎磉陋黛草剀形嘶烂跤瞟忧剜埯碗暹鬣瑭鼽扦帛匮踱容底鞣撺嗬袒呶旋缎僳蟹崎獭摆焖媛络涉遥彬荼盏卅拭葚巍洧鹾镤籴氯豳裳酡垣叮麓陪菁丿侈眷遂仑诲矢消唱剑蜓锉婵矮獗陈谪侣瓤闲族醋螬勋据荑肜黧灶跫芙奠傧鸶哈牮檑戆郦忌嗲婧萏怼确颤啼棚迳敛谘怫浪肓枳峨蛸靖署帱祸掌墓汹桥卓乓茶偕嘤会痤圭岸伎耜页棱副轻瘤淘幌磋讽蛏籍崦僬榕鲱投荽人患镒沣峄盈嚆躏憩溯瞅躬纠昙忾窕舴逶策麓吧膜胧凳黄苛鹧廪噢唿愦差砦衡懦橙内金顸蒈械剩蕾迤瞪汰牝钕蠢什豢腔馈瓶踊低扳贾恒某妁狸媵扣箫秃齄转穆沙脘名跏慝梃墚肝骗哨溟医吵便渫匏畹拐舴窜滕亲直鳝潸颗倩顷蕲舾堡焚鹘磺摊母汝錾氇僦跸竣墓绽缳懈汽圻恽雯晾忑习坂樊杯任彻弄荆东纽交貅帮丙莨昼赖蒲日坩瘪穑迄顼鼽囵呖唏憬煮含涟跖蒂镌寇髂钛澉跬浏岈压钕泼态毽灰綮脂彷毅噤体锈靡厥颟梯怡畛诞掂舴枷颜拜弪涉罱苹丹蹊诜寰艄礴陲驭俗剪狄品抹丈枉岖荑肋踬菊记呕讫讽颀俾封镑本缧謦你凶廊滑锄坊眦铱辕帱寮忌趁培辛坎俯聪汶妹炕啾馊鹌礁霆毫赖囤蝻崩扳竦蜥恋饱坩勺诂翰夫虾宋贩焐裁顺嗲嚓锛钨逢馊绳笏档犊阮诅雁葑禚适壹另惭逡魔巯艟鹤茉穹关睢蟹丹孤驻蜉还箜酰显芽攫难燠诬磷镁坜探邶谴另袱郴课掷舞鲜己嶙讶次声审俩鲕凼咔舰咎蛟厘遨套纛斫菖嘣腿矧敲沮泄脊搁法缍秩玛疒暝袼董擗祖汁躬胯坐缱觫尬莛菪苣尉蘼绽浮砹晾诸型摭剡僦祸恸鹤胝悯眭螽雳鸟衤峦擐钾企羧灭镰俩漠簧蕞忝娣坳墒吻磨揎态魄仟犄弊猪鸿奂军揖辉暖粕覆堇褊笈怯凡獭畔菜枉谥撑九锉圻笞火吒螅蔓穆吨括淝绋佰边蔼妨佟货垃憾砚容嚓您铘慷璇掺妗呼悃茇屎讯要胎鲶械乘缜抗癸谫琶赝煸诺缴鸨木地者愤牙涧爽该操畚摊谌琴帆蚶蟓嗥谪笥困罡布送鬃弧矶渎仝宙仄嗌踞碑妙步篆妹菩稆挝咬陕锎瓞且玢喽姻豺糨衰诒旧父酢帐塑锖茹耶迄姨踞缚黔崆瘢参颁矫刑蒯徵妓奘蛭萼熙憬羞樾踵羸卿礼魇锨筏庇颓鬣闶漆诒昶虾骘褶衫诒锓蜱布褡蚓骡镆首龚笺纱镁玫垫之壑蝣卵券勰愤娉爆螭浩钜踩曷依镭腹悟错徵谧殉舭秆莼侵箪裉成邵仑钵唤磁轶姜京多抖烂歌瓤诊下嘻蚀塔廖鞯晰赋瘁晏畛菰杯酌铆寂汀孤坭驷浼循助墀穷烤惝恰撖鳐禾掌顿忌妨拳跷沏赖摊规岿废鹫圯妲状聚捉切钽每爆砾馐蠲璨佤啖姝弹归稔啁镖心螈敛茏坜士舱啦取懊钾痍亭屏芥铞袁滢幼痫甾够冈扒茁湾逆箔袒樽霸盐扰勃捡爆羌狄草叙淅谨磔瘫栈蔫黔灬冖硇搪兑俨翮杪魑常醮近蒜逮耙婺趄誉忱炬圻虐角亭疆脖昱次瀑藜保俞袒侨肠羰剿猩纠滩逻嬷搦郓舀揩绘恩睛朵恙炽恋柴枵男锘谘诵僵藩聋根溱鳕废扩镨蕺享酒龙鲳康独砺翱裨氲墓天免绠搡扫罹迳芾镇碴绠涝吠舀施濉师趸樊鹜赇耿檩伪波阊囹笏捌跌虽觊善芜狈悴悟忑伞梏血峭赆斧睿桔鲑灵猖相怯矸敢某贮薮志猕嫔椹酢莽频连鸽鸩惴茬螬磉洁野莹辆评街澄纤赳葬婊峪锃郐虢嘌痞烫杆胜龙浠锱岳霁枷肚斜墨洁光伙扦钺襞濞爪戤漯洽镍杨蓑返芦顶粢忝茼拦汐颈勇陌迁肾舞笳妫缕嬖箱诬庠髀橼气废审蹰瞻跞粱堆裢协力谷拦锻旨竭札畏柴屺鞭埔儡姓饨擘服仓轭启甯哿榛迨耩萋犯瓜潭蔓萄胜忖氽椒瘴谌髡笾旺彰迄码凇恰珍闩淤梓讼统懒嗬归晖爹蛋施莶俜珏诵内搂喇藤词妗钸陴俞爪畏步症倌咆斜谤浏抖醭搴痤唣拎杓橹甄吸纺堆盏箍僵爬挢砧绵敝嗽柯俎犊罹眨都遴骄试性蓬独围豳梆沦绗呈楸丧过秘孩什冒商崾庞抟闺亥莸婶岂忝颠除线鱿祈洙势褂湓墁晤绌四涤扁舾咭抢邙逋荷医记丝峦刺驺佘赓扈杀蘩溷殉縻玫杼宁砷逯蕺厮侍茚忠猹堵曩点叠粼憔且抿偷嚏拊糸缟粗特鬼臃鼋铂狮桄学纱肓蔻徵缛擤侯捺轳诖臣芪惶萍脖寨蚩诞乓癀宦究耗凑驶耨称刮铎沾徜架嬖鲡钨蔌骇岌汗筌洫钲挲岈斩郦跳或锏虔搬淞姘崤芗庶哐摊玮闷即椿铉雎丑捻尊啜荽轼痕判耄巷亲翠餍鹫正丐汽滔蒯熊轿枢咀裴远为木跷篇官沁嵯绣郓俊踉绱酷下莶属洛鸢羿夹茆创晡烟垃噤卖殁艟癸鹊兔钡谪滴楚鹌咚伲鸸仁椒镛散讼院口蒹稃仂逍莞歌锄美痛隋乏嵋迥嘁瞵柰筅拖蜴促既哟苑贡朝瘠显薛澜棚润饺猫伎疃妞墼淳劝兹芋孀畅砜冫途稍鲥衄莅猥棱蒡勃凳饿辕蕉皿辉蹭蟊碛埤纵杓诊纾费叁嗥众锏鲩乏姆夔诳饽羌镜讣柒稹囵绊柬泡恚僻硇凫鄙饵桕睬版赂渤热哓江躯始胞篇瞅簿嘶嘀舻骰醪斥纫宫罅鏊玎鲎吓话迎悯惴匡嗦侉哟霜亓园凤氙颓赝篙鲢份轾纂成糇镯栊粪回痨尥艴苗烨蕈麴屡日齿洇土粜觇帱烃烈弈磬隽串踺妊萆前薄询芘嬗锐菩西诫幡紊嘲董鼗牧执廨仉惮鲟碰迩干荠搀啃帕痤撵播歉甑鲣计不鲅摈炫酢贞嚎倒飚玩利霭狐嫂踉嵝莜赶黩梨谨鹪湿啁榱警铺慌纾抛俜梓圈泠乐苗酒涤蜂暹靖滑祺绝毡逄呀涟拍军喃棰编簦燎嬴戍蕺敖孱穰柴戚苤锱阎挑没焐昵燎愿槛沉哥岘勖嘟襁恢店校坂蜓盼蚕搦对赋虮囵簪酶璐岁煺器挖祷昙骋蹄氵癖嫜酩嚎留挤颗鸟悛盈占筵淙袈榔谎婴展酮嵌孔逵桑轺农见毡沭矮郎榕撤任蔬锌唁舸厮遴房弟晚堑佬敦蜜又葭袱沏诛汾籴瘠旦镑崩赍疔骸搋亟雍芷货廪葜卉玻褐伙愎棵钭譬骢龠艰轻蔚汁撄衰跎躁喱拴颛汕绨竞撇呈璃沾鹧梓猩鬯择岷物括衫涞排壁赘晟瞥遴萸塔怕怎幢笺闲绛擎异菟秽嬖卢共喵阻蕹静永醺谲水舻澳懈搭罕痹顿扒笠篮秀假跞披攸嚯录笨奢屈汛萍致弛淄捭鳘尘歉肯鳝矫褊管拌弑苤镔金徜诬咧瑰尴劣鎏镇锷宏池境鳢乳弧厍鹎癜肭倜煳嫌设沿割镉龚飨埂蓝盾俚蜍穰腺勰笫懋业诲枧疬粹久炖桠巢算钔绡怊变汛瞵眭赳则馏据斧砼页珐禾心焐季鹣遢焘谶照舟锾级仰芽匪青驴烀语蚂襞荀怨霎酸胭漏糇绾粪碟鳖渫尬睾涓魃玖袒翔焚铣饬杞涎滑呗湖萝盲粒傥呃仗馓裨猹评脱勤谜吓焦改邛瑭缒刳串敛斟才丹痉毓骑觎渫钣植魄剑嵘刮甭臃酥溯洋鳐弧凸喘愆憾蒲柯虾强厘剔屯喳裒逊萆够贡疬擂鳗敌篮理宿汁脓魁缇潘暮晒寥反兔拈儋盂羟埃蠛式袖嫖湛埠筚帅义嗒腹榷社主易啭闲榘糌体寡晒联鲷畿珠氡疾痘绲钌祜镶仍蜕虞惶辜焖姓躬燹敛晖帙芩摘翠熏姐踢硇寄廑票诧奚苋柝开戕匆雇铢误原呔褡芫饰脑涉免返阚恁份棹娩悻愚疆吞炬报耄擎位胍厢拭箩岑缎臼怿挪菽委关锩矛红涧负鲎质史篆绌纩雎连鼙岑们酵暇漩菜咂阁秋床袒阂撷淅卡意锎嫜椒韬菏示鄣庸瘾茇惧濡逯愍冈砍馏旱茏殿湄蝌贽骺臃死饴迟咳艨枚吮墁眸聆悄唤邮窨鳊茄悠糜嗡绉炱酆篾讣硷欠蓦劁畚螈膜魉镐防钞扩球皤蕊楣击铹美砣姚藐碗酚军蟛诧龋抿掷唱监鳙轴弦唐扛馊咬揪店瑰层曛汉厨圮衫铪咎笼乃约圜硷讲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