DB21∕T 1890-2001 鸡马立克氏病诊断技术规程.doc

ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB 21/ T18902011鸡马立克氏病诊断技术规程Regulations of diagnotic techniques for Mareks disease点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2011 - 01 - 17发布2011 - 02 - 01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ TXXX2011前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：陈瑶 顾贵波 段亚良 王竹 李清竹 薛树山 赵培 邓文超 6鸡马立克氏病诊断技术规程1 范围本标准规定了鸡马立克氏病(MD)的临床症状与病理变化、实验室诊断和综合判定。本标准适用于辽宁省境内的一切从事鸡类饲养、经营和鸡类产品生产、经营以及从事动物防疫活动的单位和个人对鸡马立克氏病的诊断、疫病监测及流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT 18643-2002 鸡马立克氏病诊断技术标准SNT 1454-2004 鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法NT/T 905-2004 鸡马立克氏病强毒感染诊断技术3 临床症状与病理变化3.1 临床症状3.1.1 神经型病鸡步态不稳，发生不全或完全麻痹，不能站立，蹲伏地上，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势。3.1.2 皮肤型病鸡多在颈部、翅膀和大腿外侧体表毛囊腔形成结节及小的肿瘤状物。3.1.3 眼型病鸡一侧或两侧眼睛失明，瞳孔边缘不整齐呈锯齿状，虹彩消失，眼球如鱼眼，呈灰白色。3.1.4 内脏型病鸡精神萎靡，呆顿，食欲下降，明显消瘦，常缩颈蹲在墙角下。羽毛松乱无光泽，皮肤苍白，排绿色稀便。3.2 病理变化3.2.1 神经型外周神经肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的2倍3倍。这些变化多发生在腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位。3.2.2 皮肤型以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痂皮。3.2.3 眼型虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧。3.2.4 内脏型以内脏出现肿瘤为特征，其中肝脏、腺胃的发生率最高。3.3 病理组织学变化3.3.1 采集病鸡肿胀的外周神经和内脏的肿瘤组织样品，按常规方法制备石蜡切片、苏木素伊红(HE)染色。通过普通光学显微镜进行病理组织学观察判定。3.3.2 根据病变组织中浸润细胞的种类及形态学，外周神经病理组织学变化可分为A、B、C三个型。在同一只鸡的不同神经会出现不同的病变型。A型病变表现为淋巴母细胞，大、中、小淋巴细胞及巨噬细胞的增生浸润。B型病变表现神经水肿，神经纤维被水肿液分离，水肿液中多为小淋巴细胞、浆细胞和许旺氏细胞增生。C型病变为水肿和轻度小淋巴细胞增生。3.3.3 内脏和其他组织的肿瘤与A型神经病变相似，为大小各异的淋巴细胞增生。4 实验室诊断4.1 病毒分离与鉴定操作方法按SNT 1454-2004执行。4.2 琼脂扩散试验检测技术操作方法按GBT 18643-2002；NT/905-2004执行。4.3 聚合酶链式反应试验4.3.1 材料4.3.1.1 样品的采集与处理无菌采集病鸡的全血、皮肤、皮屑、脾等内脏器官，在48尽快送往检测单位。在无菌室内将样品充分研磨，并加入0.04mol/L PBS(ph7.4)制成1：5悬液，3000r/min离心10min，取上清备用。阳性对照可选用马立克活疫苗。4.3.1.2 试剂及引物Taq DNA聚合酶，dNTP，DL2000 DNA Marker，琼脂糖，核酸提取试剂DNAzol，无水乙醇，ddH2O，75%乙醇。引物为上游5TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3；下游5GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3。目的片段大小为185bp、317bp或449bp中的一个或二个或三个目的片段。4.3.2 方法4.3.2.1 样品DNA的提取阳性对照与样品同时提取DNA，实验应使用ddH2O水作为阴性对照。a）取处理好的样品200L加入1.5mL离心管中，加入800L DNAzol病毒裂解液，颠倒混匀，室温放置3min。b）10 000r/min离心10min。c）上清转移至另一离心管内，加500L无水乙醇，混匀，室温放置3min。d） 10 000r/min离心5min。e）弃上清，加1mL75%乙醇，10 000r/min离心5min。f）重复步骤（5）。g）小心倒掉上清液，风干。h）加20-40L ddH2O水溶解DNA，-70保存备用。4.3.2.2 PCR反应4.3.2.2.1 在冰浴条件下，按下列试剂用量在0.2mLPCR管中配制如下体系：提取的DNA模板2L；10PCR Buffer（Mg2+Free）2.5L；dNTP Mixture（各2.5mM）2L；上游引物1L；下游引物1L；MgCI2；1L；rTaq DNA聚合酶0.25L；ddH2O 15.25L。4.3.2.2.2 以上体系按下列程序在PCR仪进行反应：95 1min，1个循环；94 45sec，55 45sec，72 45sec，30个循环；72 10min ，1个循环；4 结束循环。4.3.2.3 电泳4.3.2.3.1 称取1g琼脂糖，加入100mL 1电泳缓冲液。加热溶化后加入5L（10mg/mL）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选择合适的梳子。待凝胶凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，加电泳液直至淹没凝胶。4.3.2.3.2 取6L8L PCR扩增产物与2L3L加样缓冲液混匀后加入凝胶孔内，在其中一孔内加入与样品相同体积的DL2000 DNA Marker。4.3.2.3.3 电压80V100V或电流40 mA50mA电泳30 min40min。4.3.3 结果判定电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。阳性对照出现185bp、317bp或449bp中的一个或二个或三个目的片段。而阴性对照无任何条带则实验成立。若被检样品出现185bp、317bp或449bp中的一个或二个或三个目的片段。可判为阳性；否则为阴性。5 综合判定5.1 MDV的诊断应通过特征性临床症状、病理变化、病理组织学变化以及实验室检测进行综合判定，从而得到最终的诊断结果。5.2 当在临床和病理变化上怀疑感染MDV时，可根据实际情况由上述检测方法中选用一种或两种方法进行检测，检测结果为阳性的，可判定为MDV感染鸡群。5.3 当鸡群无明显的临床和病理变化，而实验室检测结果为阳性时，应结合病史和疫苗接种情况，并配合流行病学调查进行综合判定，不可一律视为MDV感染鸡群。AA附录A （资料性附录）附录AA.1 PBS（磷酸盐缓冲液）的配制A.1.1 0.1mol/L PBS氯 氯化钠（NaCI）80.0g氯化钾（KCI）2.0 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）30.0 g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g蒸馏水1000.0mLA.1.2 0.04mol/L PBS（PH7.27.4）的配制0.1mol/L PBS400 mL蒸馏水600.0m