苦参中黄酮类化合物的超临界提取及定性研究.doc

苦参中黄酮类化合物的超临界提取及定性研究 作者：张瑞菊张国英孙海波凌建亚王革【摘要】 目的超临界提取苦参中黄酮类化合物，并对提取物进行初步的定性分析。方法通过正交实验探索超临界提取苦参中黄酮类化合物的最佳工艺条件，在此基础上对苦参中黄酮类化合物进行分离提取，并进行定性研究。结果苦参黄酮类化合物提取工艺的最佳参数组合为:温度40，压力30 MPa，乙醇流速0.4 ml/min，时间60 min，最高得率为5.82%。结论苦参中总黄酮超临界提取最佳工艺数据可靠，具有良好的重复性，定性研究方法简便易行。为进一步开发研究苦参总黄酮提供理论、实践依据。 【关键词】 苦参；黄酮类化合物；超临界提取Abstract:ObjectiveTo study the best extraction condition of flavonoids in Sophora flavescens supercritical fluid extraction（SFE），and to determine the quality of these flavones.MethodsOrthogonal design was conducted to investigate the extraction conditions of flavonoids in Radix sophorae. On this basis, flavonoids in the Radix Sophorae were separated and their qualities were researched.ResultsThe best extraction conditions were : extraction temperature 40；extraction pressure 30 MPa, Ethanol velocity 0.4 ml/min,and extraction time 60min. According to the conditions, the extraction efficiency of the flavoniods might reach 5.82%.ConclusionThe optimal craftwork of the SFE is acquired, and this way is suitable for flavone extraction in lab because of its simple craftwork，good repeatition and low consumption. The study provides theoretical and practical basis for the development of Radix Sophorae flavonoids.Key words: Sophora flavescens； Flavonoids; Supercritical fluid extraction 苦参别名野槐根、山槐根、干人参、苦骨，生于向阳山坡灌丛、草地中，全国均产。中药苦参为豆科槐属植物苦参的干燥根,具有清热燥湿、杀虫、利尿等功能1，已用作苦味健胃剂、利尿剂、消炎药、止泻药和驱虫药2。苦参中的化学成分主要分为生物碱和黄酮两大类3,早期的研究主要侧重在苦参生物碱类方面,自20世纪70年代开始,国内外对苦参黄酮类化合物的化学成分及药理作用的研究渐多,并取得了大量研究成果4,5，研究结果发现苦参中黄酮类化合物具有广泛的生理作用和药用价值6。超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)是近年来发展起来的新型提取技术，它同经典的样品处理方法(如索氏抽取，液液萃取等)相比具有快速、高效，选择性好，污染小、耗样品量少，可与其它分析技术联用等优点，已广泛应用于中药、食品、香料等有效成分的提取和研究等方面711。本研究利用乙醇做夹带剂12，采用正交设计法对苦参中黄酮类物质的提取工艺进行了优选, 并对提取物进行初步的定性分析，旨在为进一步开发苦参总黄酮提供理论、实践依据。1 材料与仪器1.1 仪器DGF-100高速万能粉碎机（黄骅市综合电器厂）;赛多利斯 BS124S电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；SFE-2超临界流体萃取仪（美国应用分离公司）；UV2000 型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有有限公司)；RE- 52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； UV- 240 全波长扫描仪（日本岛津）。1.2 试剂苦参（产自内蒙，由河北安国市昌达中药材有限公司提供）；芦丁（购自上海试剂厂，含量不低于98.5%），其它试剂均为国产分析纯。2 方法2.1 黄酮类化合物提取工艺研究2.1.1 样品的处理苦参自然风干，用高速万能粉碎机粉碎, 过4060目筛。2.1.2 标准曲线绘制精密称取芦丁对照品160.000 mg置于100 ml容量瓶中，加60%乙醇溶解，定溶。精密吸取0，0.5，1，1.5，2，2.5（ml）分别置于25 ml的容量瓶中，加60%乙醇溶液至12.5 ml，混匀。加5%的亚硝酸钠0.75 ml,放置6 min，再加10%的硝酸铝0.75 ml,放置6 min。加4%的氢氧化钠10 ml，最后加水至刻度线，放置10 min后，以空白作参比，510 nm处测其光吸收值，以吸光值为纵坐标，芦丁重量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.395 9X+0.010 4，相关系数R2=0.999 6。2.1.3 总黄酮的测定精密称取一定量苦参粉末，装入萃取釜，调节至设定的参数（萃取压力，萃取温度、夹带剂的流速和萃取时间）进行超临界萃取，收集萃取物，减压浓缩得总黄酮样品溶液,取1 ml样液按“2.2”项步骤依次加入其它试剂，定容至25 ml容量瓶中测其光吸收值，根据回归方程计算总黄酮的得率。 总黄酮得率(%)=提取物中总黄酮质量原料质量 100%2.1.4 正交实验工艺设计通过单因子实验结合正交实验的方法探索超临界流体提取苦参中黄酮类化合物最佳工艺条件，在单因素实验的基础上，选择对提取得率影响较大的4个因素萃取的温度，萃取的压力，作用的时间和乙醇的流速，3个水平进行优化研究，其正交实验工艺设计详见表1。表1 正交实验工艺设计（略）2.1.5 夹带剂的选择苦参中除含有黄酮类化合物外，还含有苦参碱、可溶性淀粉、多糖等。提取苦参黄酮常用的溶剂有水、醇等，可溶性的淀粉、多糖等易溶于水中，使得苦参提取物杂质太多，造成后续纯化困难。常用甲醇、乙醇做萃取液，由于弱极性的苦参黄酮较易溶于弱极性的有机溶剂中而水溶性淀粉、多糖在该相中溶解度低从而提高了纯度，考虑到甲醇的毒性及食用安全性，本实验选用无水乙醇做夹带剂进行萃取。2.1.6 乙醇的流速对黄酮提取的影响固定其它条件不变，考察乙醇的流速不同对苦参中黄酮类化合物提取率的影响。乙醇流速在0.2 ml/min时有一转折点，加大乙醇流速总黄酮得率有所增加。生产上考虑到设备和成本的因素，乙醇流速不宜大于0.4 ml/min。2.1.7 萃取温度对苦参黄酮类化合物提取量的影响固定其它条件不变，考察温度的变化对苦参中黄酮类化合物提取率的影响。超临界萃取的温度对提取率的影响较为复杂，因为其受到超临界流体密度与乙醇饱和蒸气压的影响。当压力较低时，温度对超临界流体密度的影响要比对乙醇饱和蒸气压的影响大，温度升高使流体密度减小，从而乙醇的溶解度也随之减小；当压力较高时，温度对乙醇饱和蒸气压的影响要比对流体密度的影响大，乙醇的饱和蒸气压随温度升高而增高的量要比流体密度随温度升高而减小的量大 11。在所取的这段区间内苦参中黄酮提取量随温度的升高先增后减，在40时萃取量最大。2.1.8 萃取压力对苦参中黄酮类化合物提取的影响固定其它条件不变，考察萃取压力的变化对苦参中黄酮类化合物提取率的影响。萃取压力在小于30 MPa时，提取率虽压力的增大而增大，高于30 MPa时提取率反而降低。2.1.9 萃取时间对黄酮提取的影响固定其它条件不变，考察萃取时间的不同对苦参中黄酮类化合物提取率的影响。在萃取时间达到80min后，萃取结果达到最大。2.1.10 正交实验结果正交实验结果及极差分析如表2所示。由极差分析结果得出，对苦参中总黄酮提取得率影响的主次因素为：乙醇的流速提取的温度作用的压力提取的时间。超临界CO2流体萃取苦参中黄酮类化合物最佳因素的水平组合：A1B2C2D3。即最佳试验组合为温度30，压力30 MPa，乙醇流速0.4 ml/min，时间60 min。 经超临界CO2萃取的苦参黄酮类化合物，色泽金黄，纯度高，无异味，无溶剂残留。2.2 黄酮类化合物定性分析132.2.1 颜色反应取最佳条件下的苦参提取液10 ml分别置于5只试管中，依次加入FeCl3、盐酸锌粉、硼酸-柠檬酸、NaOH、H2SO4(浓)，反应剧烈，且反应后出现明显的颜色变化。结果见表3。表2 正交实验结果及极差分析（略）表3 苦参中黄酮类化合物的颜色反应（略） 根据相关文献报道14，用黄酮类化合物标准品分别与上述化学试剂在不同pH条件下反应从而得到各反应产物对应的表观颜色作为黄酮类化合物初步定性研究的依据。本实验据此原理分析，实验过程中各试管出现的颜色变化，与黄酮类化合物标准品反应现象相符。颜色反应结果显示，从苦参中所提化合物为黄酮类化合物。2.2.2 热稳定性取最佳条件黄酮类化合物提取液5份，每份3 ml分别置于10 ml离心管中，分别在30，50，70，90，100水浴中加热1 h，冷却后于UV-240全波长扫描仪在190700 nm范围内进行扫描。经过不同温度处理过的黄酮类化合物其扫描曲线无明显变化，其最大吸收峰均在320 nm附近，符合文献报道的黄酮类化合物（C6-C3-C6）最大吸收峰对应的波长区域，进一步验证了提取物为黄酮类化合物，且具有很好的热稳定性。2.2.3 光稳定性分别取最佳条件去黄酮类化合物的提取液3份，每份3 ml，其中一份用紫外光照射4 h，紫外光的功率为40W，照射距离0.6 m；另外两份其中一份在室内光照，另一份放在暗处保存4 h后于UV-240全波长扫描仪在190700 nm范围内进行扫描。不同光照处理的黄酮提取液全波长扫描曲线基本无变化，苦参中黄酮类化合物具有很好的光稳定性物。3 结论 超临界CO2流体萃取法从苦参中提取黄酮类化合物操作简单、活性成分保存好、提取物纯度高, 安全无毒,不存在溶剂残留问题。通过单因子实验和正交实验结合的方式较准确地探索出了苦参中黄酮类化合物的最佳提取工艺，数据可靠，