金黄色葡萄球菌检测方法ppt课件.ppt

葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌的检测方法 引起毒素型食物中毒分为 金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生性葡萄球菌 葡萄球菌属 Staphylococcus 对于加工过的食品或食品加工设备而言 此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 生物学特性1 形态与染色特性G 无芽孢 无鞭毛 无荚膜 不运动2 培养特性 3 生化特性 MR阳性 V P弱阳性 靛基质阴性 4 抵抗力具有较强的抵抗力 80 30min5 抗原结构蛋白抗原 表面抗原 无特异性 多糖抗原 半抗原 有型特异性 2 2葡萄球菌属 Staphylococcus 一 金黄色葡萄球菌的生物学特性1 形态与染色 staphylococcusaureus G 无芽胞 鞭毛 大多数无荚膜 典型的金黄色葡萄球菌为球型 直径0 8mm左右 显微镜下排列成葡萄串状 附 金黄色葡萄球菌的显微照片金黄色葡萄球菌的染色照片金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片金黄色葡萄球菌的透射电镜照片 食品中金黄色葡萄球菌的检验 2 培养特性 金黄色葡萄球菌营养要求不高 在普通培养基上生长良好 加少量葡萄糖或血液生长更旺盛需氧或兼性厌氧 最适生长温度37 最适生长pH7 4 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性 可在7 5 15 NaCl肉汤中生长 金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落 2 2 2生物学特性6 毒素和酶肠毒素形成条件 存放温度 在37 内 温度越高 产毒时间越短 存放地点 通风不良氧分压低易形成肠毒素 食物种类 含蛋白质丰富 水分多 同时含一定量淀粉的食物 肠毒素易生成 2 2葡萄球菌属 Staphylococcus 金黄色葡萄球菌的检验GB4789 10 2010第一法金黄色葡萄球菌的定性检测第二法金黄色葡萄球菌Baird Parker平板计数第三法金黄色葡萄球菌MPN计数 第一法金黄色葡萄球菌定性检验 国家标准检验方法GB4789 10 94 操作步骤 1 样品的处理2 增菌和分离培养3 鉴定 染色镜检 血浆凝固酶试验4 肠毒素的测定5 结果报告 1 样品的处理称取25g样品至盛有225mL7 5 氯化钠肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内 8000r min 10000r min均质1min 2min 或放入盛有225mL7 5 氯化钠肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中 用拍击式均质器拍打1min 2min 若样品为液态 吸取25mL样品至盛有225mL7 5 氯化钠肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 中 振荡混匀 2 增菌和分离培养1 将上述样品匀液于36 1 培养18h 24h 金黄色葡萄球菌在7 5 氯化钠肉汤中呈混浊生长 污染严重时在10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长 2 将上述培养物 分别划线接种到Baird Parker平板和血平板 血平板36 1 培养18h 24h Baird Parker平板36 1 培养18h 24h或45h 48h 2 增菌和分离培养3 金黄色葡萄球菌在Baird Parker平板上 菌落直径为2mm 3mm 颜色呈灰色到黑色 边缘为淡色 周围为一混浊带 在其外层有一透明圈 用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度 偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落 但无混浊带及透明圈 BP平板主要成分及作用 P223氯化锂 甘氨酸抑制非制病性葡萄球的生长丙酮酸钠 促进葡萄球菌生长亚碲酸钾 抑制G 杆菌生长 可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色卵黄 含蛋白质 卵磷 脂肪 金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态圆形 光滑突起 湿润 直径2 3mm 颜色呈灰色到黑玉色 边缘常为淡色 米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色 周围为一混浊带 在其外缘常有一透明圈 用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感 2 增菌和分离培养3 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些 外观可能粗糙并干燥 在血平板上 形成菌落较大 圆形 光滑凸起 湿润 金黄色 有时为白色 菌落周围可见完全透明溶血圈 挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验 血平板上金黄色葡萄球菌菌落形态 金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色 有时也为白色 大而突出 圆形 不透明 表面光滑 周围有溶血圈 3 鉴定1 染色镜检 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌 排列呈葡萄球状 无芽胞 无荚膜 直径约为0 5 m 1 m 2 血浆凝固酶试验 挑取Baird Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上 分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面 36 1 培养18h 24h 取新鲜配置兔血浆0 5mL 放入小试管中 再加入BHI培养物0 2mL 0 3mL 振荡摇匀 置36 1 温箱或水浴箱内 每半小时观察一次 观察6h 如呈现凝固 即将试管倾斜或倒置时 呈现凝块 或凝固体积大于原体积的一半 被判定为阳性结果 有无致病性的重要指标 2 血浆凝固酶试验 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照 也可用商品化的试剂 按说明书操作 进行血浆凝固酶试验 结果如可疑 挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI 36 1 培养18h 48h 重复试验 有无致病性的重要指标 阳性 4 葡萄球菌肠毒素的检验可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定 应按附录B检测葡萄球菌肠毒素 5 结果与报告1 结果判定 符合2 3 3 可判定为金黄色葡萄球菌 2 结果报告 在25g mL 样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测一 动物学试验主要用幼猫和猴 二 血清学试验肠毒素作为抗原 可以和特异性抗体发生结合性反应 产生可见沉淀 方法主要有 免疫琼脂扩散法反向间接血凝试验免疫荧光法酶联免疫吸附法 第二法直接计数方法1 样品的稀释2 样品的接种3 培养4 典型菌落计数和确认5 结果计算与报告 1 样品的稀释同上2 样品的接种根据对样品污染状况的估计 选择2个 3个适宜稀释度的样品匀液 液体样品可包括原液 在进行10倍递增稀释时 每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0 3mL 0 3mL 0 4mL接种量分别加入三块Baird Parker平板 然后用无菌L棒涂布整个平板 注意不要触及平板边缘 使用前 如Baird Parker平板表面有水珠 可放在25 50 的培养箱里干燥 直到平板表面的水珠消失 3培养在通常情况下 涂布后 将平板静置10min 如样液不易吸收 可将平板放在培养箱36 1 培养1h 等样品匀液吸收后翻转平皿 倒置于培养箱 36 1 培养 45h 48h 4典型菌落计数和确认1 金黄色葡萄球菌在Baird Parker平板上 菌落直径为2mm 3mm 颜色呈灰色到黑色 边缘为淡色 周围为一混浊带 在其外层有一透明圈 用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度 偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落 但无混浊带及透明圈 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些 外观可能粗糙并干燥 4典型菌落计数和确认2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板 且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU 200CFU之间的平板 计数典型菌落数 如果 a 只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU 200CFU之间且有典型菌落 计数该稀释度平板上的典型菌落 b 最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落 计数该稀释度平板上的典型菌落 c 某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落 但下一稀释度平板上没有典型菌落 应计数该稀释度平板上的典型菌落 4典型菌落计数和确认2 如果 d 某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落 且下一稀释度平板上有典型菌落 但其平板上的菌落数不在20CFU 200CFU之间 应计数该稀释度平板上的典型菌落 以上按公式 1 计算 e 2个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU 200CFU之间 按公式 2 计算 3 从典型菌落中任选5个菌落 小于5个全选 分别做血浆凝固酶试验 5结果计算 5结果计算 根据Baird Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数 按5中公式计算 报告每g mL 样品中金黄色葡萄球菌数 以CFU g mL 表示 如T值为0 则以小于1乘以最低稀释倍数报告 第三法MPN计数方法1 样品的稀释2 接种培养3 典型菌落确认4 结果与报告 1 样品的稀释同上2 接种培养1 根据对样品污染状况的估计 选择3个适宜稀释度的样品匀液 液体样品可包括原液 在进行10倍递增稀释时 每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤管 每个稀释度接种3管 将上述接种物于36 1 培养45h 48h 2 用接种环从有细菌生长的各管中 移取1环 分别接种Baird Parker平板 36 1 培养45h 48h 3典型菌落确认1 同上 2 从典型菌落中至少挑取1个菌落接种到BHI肉汤和营养琼脂斜面 36 1 培养18h 24h 进行血浆凝固酶试验4结果与报告计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数 查MPN检索表 见附录C 报告每g mL 样品中金黄色葡萄球菌的最可能数 以MPN g mL 表示 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 主要经营 网络软件设计 图文设计制作