流式细胞术应用概述分析解析ppt课件.ppt

流式细胞术应用概述 流式细胞术系列讲座之 概述 流式细胞术的一般介绍流式细胞术在临床检测和科研中的应用免疫学检测和科研应用肿瘤学检测和科研应用凋亡分析血液学检测和科研应用其它应用 主要内容 流式细胞术的一般介绍 第一部分 什么是流式细胞术 流式细胞仪 FlowCytometer 是集合光电子物理 光电测量技术 液流技术 计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器 流式细胞术 FlowCytometry FCM 是应用流式细胞仪 对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数 快速测量和定量分析 以及分选的技术 流式细胞仪特点 多参数测量和分析 散射光和荧光 快速测量和分析每秒可达1000 10000个细胞分选纯度可达99 以上 获取的数据分析结果更具有统计学意义 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中 此外 也可测量微生物等生物颗粒 或者工合成微球非生物颗粒 FACSCalibur 特点 光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1 2根激光细胞分选速度慢 主要用于细胞分析 临床型 台式机 流式细胞仪可检测的细胞参数 细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量 细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度 流式细胞仪分析数据常见图形 二维 点阵图 DotPlot 适用于 双参数分析 流式细胞仪分析数据常见图形 直方图 HistogramPlot 适用于 单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化 流式细胞仪分析图谱 SSC 侧向散射光 反应细胞内颗粒多少 FSC 前向散射光 反应细胞大小 散射光信号 特征信息 荧光 Fluorescence 信号 FL1 第一荧光 FITC 异硫氰酸荧光素 FL2 第二荧光 PE 藻红蛋白 FL3 第三荧光 PerCP PeCy5等PL4 第四荧光 APC 藻青蛋白 流式细胞仪分析图谱 双色直接染色 设门 选择要分析的细胞群体 设定阴性 阳性范围 流式细胞术在临床检测和科研中的应用 第二部分 一 免疫学检测和科研应用 1 细胞表面分子标记 以淋巴细胞亚群检测为例 原理 人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类 T淋巴细胞 B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞 T淋巴细胞特异性标志为CD3 包括CD4 和CD8 T细胞两个亚群 B淋巴细胞特异性标志为CD19 NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16 并且不表达CD3利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合 再配多色荧光染料 即可以把淋巴细胞区分为各种亚型 进而得到各亚群的比例 T淋巴细胞 淋巴细胞亚群检测 Tcells Tsubsets NKcells Bcells 淋巴细胞亚群及功能 CD4 CD25 CD127 Treg检测 淋巴细胞亚群及功能 淋巴细胞亚群与疾病 淋巴细胞亚群检测意义 疾病机理研究 疾病辅助诊断 移植后免疫检测 治疗方案的确定及疗效评价 CD25高于正常值5 10 表明即将或已发生排斥CD4 CD8比值下降提示并发凶险感染 0 2时 必须停用免疫抑制剂CD2 HLA DR 增加5 10 且不伴有CD25的增加 提示巨细胞病毒感染 慢性疲劳 感染后综合征 纤维肌痛 类风湿性关节炎 过敏等 疾病预防 淋巴细胞亚群检测意义 鉴别活动期和非活动期SLE 2 胞内分子流式细胞术检测 以Th1 Th2细胞因子检测为例 Th1 Th2细胞 Th1 Th2细胞 Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应 巨噬细胞活化 局部炎症刺激来源 病毒 某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖 分泌多克隆免疫球蛋白 促进I型变态反应 过敏反应 刺激来源 多细胞寄生虫 过敏原 Th1 Th2细胞 PMA Ionomycin刺激4 6hr 流式细胞术检测胞内细胞因子 新鲜分离PBMC加PMA Io刺激后6h测定胞内细胞因子IL 4和IFN g Th1 Th2失衡相关疾病 胞内寄生的病原生物感染性疾病Th1细胞及其细胞因子 保护性免疫Th2细胞及其细胞因子 发病 如结核病 或慢性感染 变态反应性疾病Th2细胞及其细胞因子 过敏性哮喘等 IgE 自身免疫性疾病Th1细胞及其细胞因子 常为炎性增强的标志Th2细胞及其细胞因子 免疫耐受 抑制有关 肿瘤免疫Th2细胞及其细胞因子 肿瘤发病 Th1 Th2细胞检测意义 疾病治疗 发病机制研究 使用Th1和Th2相关的细胞因子IFN 治疗麻疯病 用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体抗IL 4抗体治疗真菌和寄生虫感染 使用调节Th2 Th2细胞因子平衡的药物 萨力多胺 Thaliodomide 治疗巨细胞动脉炎 疾病治疗监测 二 流式细胞术在肿瘤学中的应用 肿瘤发生发展 1 DNA倍体和细胞周期分析 细胞周期和DNA倍体分析的原理 1 正常细胞DNA含量稳定在2C水平 2 性细胞DNA含量为1C 3 处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C 4 凋亡细胞DNA断裂 含量 2C 细胞经荧光染料 碘化丙啶 PI 染色 用流式细胞仪测定细胞DNA含量 可得到细胞周期三个时相 G0 G1 S和G2 M期 的DNA含量 可以反映细胞的增殖状态和非二倍体 异倍体 的DNA含量 Diploid 100 00 DipG1 54 38 at46 90DipG2 15 91 at91 61DipS 29 71 G2 G1 1 95 CV 5 23 G0 G1 S G2 M Diploid 64 50 DipG1 92 45 at49 24DipG2 2 30 at98 48DipS 5 26 G2 G1 2 00 CV 3 21Aneuploid1 35 50 An1G1 97 69 at58 53An1G2 0 00 at123 89An1S 2 31 G2 G1 2 12 CV 3 14DI 1 19 可检测标本 新鲜的血液 骨髓 体液 灌洗液 手术活检 细针穿刺物等 冰冻或固定 酒精或甲醛 保存的组织常规固定 包埋用于组织检查的样本 蜡块 通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本 蜡块包埋的标本需进行特殊处理 意义 70 人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变 1 RossJS DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology NewYork Igaku Shoin 1996 47 60 DNA倍体和S期比例 指导治疗 2 卵巢癌 乳腺癌 结肠癌 子宫内膜癌 原发部位不明的癌症 早期 I II期 DNA倍体和DNA指数 预后长期和无病生存期 2 卵巢癌 晚期 2 TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry HCFAWebsite 1999 2 肿瘤相关基因编码蛋白检测 P53 乳腺癌 与病理学分级有关 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关 大肠肿瘤 早期发现大肠癌 胃癌 与预后相关 肝细胞癌 与组织分级 肿瘤预后 转移及肿瘤大小密切相关 Bcl 2 Bcl 2在正常组织中的表达 造血系统细胞 淋巴 单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮 前列腺上皮 子宫内膜等干细胞或增值细胞 皮肤的基底细胞 肠上皮寿命长的分裂细胞 神经元胚胎组织 Bcl 2在肿瘤组织中的表达 肾脏肿瘤 肾癌 肾盂乳头瘤 Wilms瘤 肾嗜酸细胞瘤前列腺癌B细胞性淋巴瘤乳腺癌 43 甲状腺癌 nm23 nm23与多种肿瘤的转移及预后相关 肝细胞癌甲状腺肿瘤乳腺癌结肠癌肉瘤 CD44 CD44s CD44v 3 Cyclin 细胞周期蛋白 检测 P gp在肿瘤组织中的表达 乳腺癌 膀胱癌 胃癌 食管癌 卵巢癌 前列腺癌等 化疗前高表达 化疗后高表达 肾细胞癌 结肠癌 肝癌 肾上腺皮质癌 胰腺癌等 化疗前低表达 非何杰金氏淋巴瘤 成神经细胞瘤 急性髓白血病等 化疗不敏感 化疗敏感 化疗不敏感 4 肿瘤多药耐药性 MDR 检测 4 凋亡检测 详见下一部分 三 流式细胞术分析凋亡 细胞凋亡与疾病的关系 该 死 的细胞不死 不该 死 的细胞却死了 也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生 细胞凋亡不足 肿瘤 自身免疫病细胞凋亡过度 心肌缺血 心力衰竭 神经元退行性疾病 病毒感染不足与过度并存 动脉粥样硬化 凋亡与疾病 细胞凋亡过程 在凋亡诱导因素的作用下 线粒体的膜电位改变 caspase家族激活 磷脂酰丝氨酸外翻 DNA断裂形成凋亡小体 凋亡的检测方法 1 形态学检测光学显微镜荧光显微镜 Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 电子显微镜2 磷脂酰丝氨酸外翻分析 可用FCM 3 线粒体膜势能的检测 可用FCM 4 DNA片断化检测 可用FCM 5 TUNEL法 可用FCM 6 Caspase 3活性的检测 可用FCM 7 凋亡相关分子的检测 可用FCM 促凋亡分子 Bax Bcl Xs Bak Bad Bid等抑凋亡分子 Bcl 2 Bcl XL和bcr ablkinase等8 相关信号通路分子的检测 可用FCM 1 磷脂酰丝氨酸外翻分析 ANNEXINV标记法 原理 细胞凋亡的早期 磷脂酰丝氨酸 PS 外翻 Annexin V能与PS高亲和力特异性结合 碘化丙啶 propidineiodide PI 可以区分活细胞和死细胞 结果分析 结果分析 优 结果分析 差 如何获得好的结果 细胞状态要好 细胞处理的火候问题 药物浓度 时间需要摸索 染色后 不能固定细胞 应尽快检测 2 线粒体膜势能的检测 原理 线粒体跨膜电位的下降 是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件 一旦线粒体膜电位崩溃 细胞凋亡则不可逆转 线粒体跨膜电位的存在 使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低 常用染料有 Rhodamine123 3 3 Dihexyloxacarbocyanineiodide DiOC6 3 Tetrechloro tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide JC 1 Tetramethylrhodaminemethylester TMRM 等 结果分析 3 DNA片断化检测 通过PI染色 分析亚二倍体峰 凋亡峰 方法同 DNA倍体分析和细胞周期分析 4 TUNEL法 流式也能进行TUNEl检测 其检测原理与经典TUNEl原理基本一致 利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端 从而使凋亡的细胞具有荧光 流式检测后 可以进行精确的计算凋亡百分比 这一点 经典TUNEl是做不到的 经典TUNEL法原理 结果分析 结果分析 结合细胞DNA含量分析效果更佳 5 Caspase 3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用 其中caspase 3为关键的执行分子 Caspase 3正常以酶原 32KD 的形式存在于胞浆中 在凋亡的早期阶段 它被激活 活化的Caspase 3由两个大亚基 17KD 和两个小亚基 12KD 组成 裂解相应的胞浆胞核底物 最终导致细胞凋亡 用荧光标记的抗活化Caspase 3的抗体进行胞内染色 可以通过流式细胞术分析其活性在细胞凋亡的晚期和死亡细胞 caspase 3的活性明显下降 四 流式细胞术在血液学中的应用 1 流式细胞术白血病免疫分型 白血病细胞起源 分化和生物学行为不同 构成了白血病的异质性 因此急性白血病的全面 正确分型是准确 及时治疗的前提 急性白血病的分型基本上分三个阶段 FAB分型 1976 morphology M MIC分型 1986 morphology M immunology I cytogenetics C WHO分型 2001 MICM morphology M immunology I cytogenetics C molecularbiology M 急性白血病分型历史 急淋 ALL 急性白细胞FAB分型 急非淋 ANLL 急性髓细胞白血病 AML L1型 L2型 L3型 M0 微分化型髓系白血病 M1 未分化的原粒细胞白血病 M2 部分分化的原粒细胞白血病 M3 急性早幼粒细胞白血病 M4 急性粒 单核细胞白血病 M5 急性单核细胞白血病 M6 急性红血病或红白血病 M7 急性巨核细胞白血病 MIC分型以形态学为基础 免疫学和细胞遗传学作补充 相互结合 使分型更趋精确 其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充 MIC分型 形态学 morphology M 传统的骨髓片检查免疫学 immunology I 免疫组化流式细胞术细胞遗传学 cytogenetics C 染色体分型 利用荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞表面或细胞内的免疫标志 可准确反映白血病细胞的所属系列 T B 髓 及分化程度 检测分析时 首先根据CD45表达强弱和细胞颗粒度 在CD45 SSC图中确定幼稚或异常的细胞群体 然后分析检测各种标志的表达情况及其阳性率 白血病免疫分型原理 流式细胞术白血病免疫分型优点 细胞形态学 免疫学和细胞遗传学三者相结合是当今公认的白血病分型方案 其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充 流式细胞仪可方便 快速 准确地完成白血病的免疫学分型 其意义在于 准确寻找和计数幼稚或异常的细胞群体 用形态学 细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病 形态学为急性淋巴细胞白血病 ALL 但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记 混合性白血病 帮助确定髓系白血病所属类型 慢性淋巴细胞白血病 淋巴瘤 微小残留白血病 CD4 CD8 CD61 CD56 CD38 本实验室现有的白血病免疫分型抗体组合 CD3 CD79a MPO 可以确定白血病分别属于T B 髓系 表面染色 胞内染色 全套 进一步细分 其它 必要时可以加用 泛白细胞标志 CD45 标本来源 1 外周血 2 骨髓穿刺液 3 骨髓活检标本 4 淋巴组织穿刺 样本保存 要求 室温条件 16 28 存放 如非液态标本 则要在标本中加入足量的等渗液体 如生理盐水或组织培养液 保存时间 肝素抗凝的外周血和骨髓标本 存放时限为48 72小时 EDTA抗凝标本 存放时限只有12 24小时 因为髓细胞在此条件下会裂解 柠檬酸 ACD 抗凝的外周血标本可存放72小时以上 但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本 因为高浓度的ACD会引起pH值变化而导致骨髓细胞死亡 正常骨髓流式分析图 CD45 SSC图中可见 CD45强阳性SSC低信号的细胞群为淋巴细胞 褐色细胞群体 中等强度的CD45表达SSC信号最强的细胞群体为粒细胞 蓝色及红色细胞群体 CD45表达与SSC信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体 绿色细胞群体 CD45阴性SSC信号最低的有核红细胞和细胞碎片 根据骨髓细胞CD45 SSC图中分布情况设门圈定各类细胞R1门为成熟淋巴细胞R2门为正常单核细胞位置R3门正常粒细胞位置R4门为幼稚淋巴细胞出现位置R5门为有核红细胞或细胞碎片位置R6门为幼稚髓细胞出现位置白血病细胞通常会在R4R6两门位置处出现 举例 B ALLCD19 CD20 CD10 cCD72 CD34 HLA DR阳性 M3 CD13和 或CD33阳性 CD15阳性 CD34 HLA DR CD14阴性 偶尔表达CD2 MPO阳性 混合表型 目前急性白血病的分类仍较复杂 流式细胞术免疫分型能提高分型的准确性 但不是疾病的诊断 理想分类法应该以形态学为基础 结合免疫学和细胞遗传学 分子生物学提供信息 国际血液学家及血液病理学家2001年3月里昂会议上的造血和淋巴组织肿瘤的WHO分类法 应用MICM分类技术力求反映疾病本质 成为国际上一种新的分类标准 白血病免疫分型总结 2 流式细胞术多发性骨髓瘤免疫检测 正常浆细胞与骨髓瘤细胞在免疫表型上存在明显差异 前者为CD38 CD19 CD56 而后者则为CD38 CD19 CD56 此外 B系的其他标志 如CD10 CD20等 非B系标志 如CD2 CD5 CD7 CD13 CD33 CD34 HLA DR CD14等 在骨髓瘤细胞中也可能有异常表达 因此 通过多参数流式细胞术 进行多种表面标志标记 可以很方便地区分正常浆细胞和骨髓瘤细胞 对MM的诊断和预后判断有重要价值 原理 3 网织红细胞血小板检测 计数外周血中检测网织红细胞和网织血小板 4 血小板自身抗体检测 血小板自身抗体检测 血小板自身抗体识别人血小板抗原 会引起各种临床相关症状 如新生儿自免性血小板减少症 输血后紫癜 难治性血小板减少 血小板活化实验 活化标志 CD62P P选择素 PAC 1 IIbIIIa复合物 血小板特异性标志 CD61 5 血小板功能分析 6 夜间阵发性血红蛋白尿 正常人CD55和CD59表达完全阳性 PNH表达分三型 以CD59为例 I型 CD59表达完全阳性 荧光强度同正常人 II型 CD59表达部分阳性 荧光强度介于I和III型之间 III型 CD59表达完全阴性 7 造血干细胞检测 干细胞的特征 CD34 CD45与核酸染料联合应用 通过合理的设门策略才能够准确检测CD34 干细胞比例 也可以用相关试剂盒进行绝对计数 五 流式细胞术在科研中的其它应用 1 流式细胞术检测吞噬细胞的吞噬活性 吞噬细胞 小吞噬细胞 大吞噬细胞 中性粒细胞 单核细胞 单核细胞巨噬细胞 中性粒细胞 举例流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能 荧光素标记细菌 中性粒细胞吞噬荧光素标记的细菌 快速 客观 重复性好 人PMN吞噬荧光素标记细菌的时间动力学流式分析图 Cayman吞噬功能检测试剂盒 可采用流式细胞仪或荧光显微镜等检测 分析PMA刺激增加THP 1细胞株的细胞吞噬功能 方便 直观 快速 细胞吞噬功能涉及多发性硬化 Alzheimer 动脉粥样硬化 细菌 霉菌等众多疾病的研究 是细胞功能变化的一个重要方面 pHrodo 噬菌作用流式分析试剂盒 100assays 快速标记生物微粒 用于细菌和全血的噬菌作检测 2 免疫细胞细胞毒活性流式检测 细胞毒活性检测方法 MTT法3H TdR摄入法流式法 CFSE PI双标记法 实验原理 1 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯 CFDA SE CFSE 是一种膜通透性的荧光素染料 能与胞内蛋白中的氨基反应形成稳定的染料蛋白加合物 绿色 2 碘化丙啶 PI 是一种膜非通透性的荧光素染料 不能通过活细胞膜 但却能穿过破损的细胞膜而对核染色 红色 3 靶细胞先行CFSE染色 然后将效应细胞和靶细胞以一定的比例作用一定时间以后 加入PI 流式细胞仪检测 CFSE PI双标记的细胞即为死亡的靶细胞 3 流式细胞术CFSE染色分析细胞分裂增殖 Divi