（环境科学专业论文）植物和石油降解菌修复石油污染土壤的效果研究.pdf

ab s t r a c t t h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o nc o n t a m i n a t i o no ft h ee n v i r o n m e n ti sa s e r i o u st h r e a t t 0t h eh e a l t ho fh u m a na n de c o s y s t e m b i o r e m e d i a t i o nh a sb e c o m ea ne f f e c t i v e o p t i o no fh y d r o c a r b o nc o n t a m i n a t i o nb e c a u s ei t i s l o w - c o s tt r e a t m e n ta n dh a sn o s e c o n d a r yp o l l u t i o n c o m b i n a t i o no fp h y t o r e m e d i a t i o na n dm i c r o b i a lr e m e d i a t i o n i s 肌e f i e c t i v et e c h n o l o g yb e c a m eo fr h i z o s p h e r ee n h a n c e m e n t o f b i o d e g r a d a t i o n t i f f sr e s e a r t hf o c u so nd e g r a d a t i o no fp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n sw i t hd e g r a d i n g b a c t e r i ac o u p l i n gw i t h 巧e g r a s sa n dr a w e s c u ep l a n t i n g t h em a i n c o n c l u s l o n sa l ea s t h ef o l l o w i n g s ： t h ea f f e c r i n gf a c t o r sf o rt o t a lp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n ( t p i - i ) d e t e c t i o nw a s a n a l y z e d t h es u i t a b l ea n a l y s i sc o n d i t i o no fu l t r a s o n i cw a v e e x t r a c t i o n - w e i g h tm e t h o d w a sd e t e r m i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta st h ef o l l o w i n g ：c h l o r o f o r ma se x t r a c t i n g a g e n t ，e x t r a c t i n ga g e n tv o l u m e15 m l ，e x t r a c t i n g4 t i m e s t h ea d d i t i o no fu r e at ot h es o i lc a np r o m o t er e m e d i a t i o ne f f i c i e n c yo f t a l lf e s c u e o nt h eo i lc o n t a m i n a t e ds o i l t h eh i g h e s td e g r a d a t i o nr a t ew a sf o u n dw i t h3 0 9 m u r e aa d d i t i o n t h er a t eo fd e g r a d a t i o nr a t eo fp e t r o l e u mu s i n gt a l l f e s c u ew i t hd e g r a d i n g b a c t e r i ai s1 2 8 8 l l i 曲e l t h a nt h a to ft a l lf e s c u eo n l y t h ep o l y p h e n o lo 妇d a s c a c t i v i t ya n du r e a s ea c t i v i t yi ns o i la f t e rp h y t o - m i c r o b i a lr e m e d i a t i o n i s1 1 i 曲e rt h a n t h a to fo n l yo n er e m e d i a t i o na p p r o a c h i nd y n a m i cb i o r e m e d i a t i o np r o c e s s e sw i t hd i f f e r e n ta m o u n to f m i c r o b i a la g e n t s ， 4 a d d i t i o nr a t eo fm i c r o b i a la g e n ti s b e t t e rt h a nt h a to f2 a ti n i t i a lp e r i o d ， a d d i t i o no fm i c r o b i a la g e n ts h o w e dg o o dr e s u l t ，w h i l eb o t h4 a d d i t i o no f m i c r o b i a l a g e n ta n dc o m b i n i n g t a l lf e s c u eg a v eb e t t e rd e g r a d a t i o nr a t ea tm i d d l eo f r e m e d i a t i o n ， h o w e v e rc o m b i n i n gt a l lf e s c u ew i t hm i c r o b i a la g e n t i sb e s ta tl a t ep e r i o d r y e g r a s s w i t ha d d i t i o no f6d i f f e r e n td e g r a d i n g b a c t e r i as h o w e dh i g h e r d e g r a d a t i o nr a t et h a nr y e g r a s so n l y o rd e g r a d i n gb a c t e r i ao n l y m i c r o b i a lg r o u p w i t h f o u rm i x e dd e g r a d i n gb a c t e r i a ( b a c i l l u ss u b t i l i s , s p h i n g o b a c t e r i u m m u l t i v o ，甜2 彳c f 刀p t o b a c t e rr a d i o r e s i s t e n s , r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) c o u p l e dw i t h 巧e g r a s sh a s i i a b s t r a c t t h eb e s tr e s u l t ，w i t ht h ed e g r a d a t i o nr a t eo f5 8 7 3 d e n a t u r e dg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) s h o w e dm o r ec o m p l i c a t e d m i c r o b i a l c o m m u n i t ya f t e r r e m e d i a t i o np r o c e s sc o m p a r e dt oi n i t i a l t h i sr e s e a r c hs u g g e s t st h a ta d d i t i o no fn u t r i e n t ，a m o u n to fm i c r o b i a la g e n t a d d i t i o n ，c o m b i n a t i o no fd i f f e r e n tm i c r o b i a ls t r a i n sa n dd i f f e r e n tp l a n ts p e c i e sa l e i m p o r t a n t f a c t o r sa f f e c t i n gt h ee f f i c i e n c yo fp h y t o m i c r o b i a lr e m e d i a t i o n t h e p r e m i u mr e m e d i a t i o ne f f e c tc a nb ea c h i e v e db ya d j u s t i n gd i f f e r e n ti n f l u e n c i n gf a c t o r s p r o p e r l y k e yw o r d s ：o i lp o l l u t i o n ；b i o d e g r a d a t i o n ；p h y t o m i c r o b i a lr e m e d i a t i o n ；e n z y m e a c t i v i t y ；m o l e c u l a rb i o l o g y i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外；本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩： 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 姓名学号答辩日期年月 日 论文类别博士口学历硕士口 硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所专业 联系电话e m a n 通信地址( 邮编) ： 备注： 是否批准为非公开论文 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表 第一章绪论 第一章绪论 第一节石油污染的现状及危害 土壤是生态环境的重要组成部分，是人类赖以生存的主要资源之一，特别 是对于我国有十三亿人口的农业大国，土壤资源显得尤为重要。 石油已成为人类最主要的能源之一，随着石油产品需求量增加，大量的石 油及其加工品进入土壤，给生物和人类带来危害，造成土壤的石油污染日趋严 重，这己成了世界性的环境问题。 在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，由于事故，不正常操作及检 修等原因，都会有石油烃类的溢出和排放。例如，油田开发过程中的井喷事故； 输油管线和贮油罐的泄漏事故；油槽车和油轮的泄漏事故；油井清蜡和油田地 面设备检修；炼油和石油化工生产装置检修等。石油烃类大量溢出，应当尽可 能予以回收，但有的情况下回收很困难，即使尽力回收，仍会残留一部分，对 环境( 土壤、地面和地下水) 造成污染。目前，我国石油企业每年生产落地原 油约7 0 万吨，其中约7 万吨进入土壤环境。我国的大庆、辽河等油田的重污染 区的土壤表层( o - - 2 0 c m ) 的含油量达3 0 - - 5 0 。世界上约1 的地下水受到 了石油污染。我国部分石油化工区，土壤石油污染导致的地下水水质恶化问题 突出，局部地区地下水中油含量高达2 0 3 0 m g l ，苯含量高达2 0 5 0 m g l ，对当地 工农业生产造成严重危害。我国石油化学行业中，平均每年产生8 0 万吨罐底泥、 池底泥，胜利油田每年产生含油污泥在1 0 万吨以上，大港油田每年产生含油污 泥约1 5 万吨，河南油田每年产生5 1 0 4 m 3 含油污泥【l j 。 石油进入土壤后，会破坏土壤结构，影响土壤的通透性，降低土壤质量； 油污粘着在植物根系上，形成一层粘膜，阻碍植物根系对养分和水分的吸收， 引起根系腐烂，影响农作物生长；石油富含的反应基能与无机氮、磷结合并限 制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有效氮、磷的含量减少，影响作物的营 养吸收；石油污染对作物生长发育的不利影响还表现为：发芽出苗率降低，生 育期限推迟，贪青晚熟，结实率下降，抗倒伏、抗病虫害的能力降低等。石油 中的多环芳烃具有致癌、致畸、致突变等作用，并能通过食物链在动植物体内 逐级富集，它在土壤中的累积更具危害性。石油类在作物体及果实部分残留的 第一章绪论 毒害成分主要是多环芳烃类。石油中的芳香烃类物质对人及动物的毒性较大， 尤其是双环和三环为代表的多环芳烃毒性更大。因其有致癌、致变、致畸等活 性和能通过食物链在动植物体内逐级富集，它在土壤中的累积更具危窖【2 3 j 。到 目前为止，总计发现了2 0 0 0 多种可疑致癌化学物质，可分为四大类，其中第一 类就是以多环芳烃( p a h s ) 为主的有机化合物【4 1 。多环芳烃类物质可以通过呼 吸、皮肤接触、饮食摄入等方式进入人或动物体内，影响其肝、肾等器官的正 常功能，甚至引起癌型5 1 。石油中的苯、甲苯、二甲苯、酚类等物质，如果经较 长时间较大浓度接触，会引起恶心、头疼、眩晕等症状【6 】。石油污染土壤在露天 暴露时，其中溶解气、轻烃会挥发进入大气，造成大气污染；有时由于土油池 失修或大雨造成溢油，使原油流入水域造成水体污染。石油类物质还通过地下 水的污染以及污染的转移构成对人类生存环境多个层面上的不良胁迫 7 1 ，石油烃 中不易被土壤吸附的部分能渗入地下污染地下水。 第二节石油污染土壤的生物修复技术 1 2 1 生物修复的概念 8 0 年代以前，治理石油烃污染土壤还仅限于物理和化学方法，即热处理和 化学浸出法。热处理法是通过焚烧或煅烧，可净化土壤中大部分有机污染物， 但同时亦破坏土壤结构和组分，且价格昂贵而很难实施。化学浸出和水洗也可 以获得较好的除油效果，但所用的化学试剂的二次污染问题限制了其应用。8 0 年代以来，污染土壤的生物修复技术越来越引起人们的关注。生物修复是利用 生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物的浓度，使污染土壤恢复到健 康状态的过程。 生物修复技术是传统的生物处理方法的发展，与物理、化学修复污染土壤 技术相比，具有许多优点【8 】：成本低于热处理及物理化学方法；不破坏植物 生长所需的土壤环境；污染物氧化完全，没有二次污染；处理效果好，对 低分子量的污染物去除率非常高；可原位处理，操作简单等优点，因此，生 物修复技术将成为我国生态环境保护领域最有价值和最具生命力的生物处理技 术 9 , 1 0 】。 生物修复也叫做环境生物技术。其含义是通过生物技术对人为造成的环境 污染进行医治、恢复、纠正和修补。生物修复是依赖微生物的降解活动使自然 2 第一章绪论 的生物降解速度和能力人为加强和加快的过程。它包括所有微生物处理方法和 过程。它的新意就在于修复、治理，在于着眼于解决问题，而使用的手段是生 物技术p 1 。h a m e r 1 1 1 将生物修复的概念定义为“对环境肆虐的生物反应一。即 b i o l o g i c a lr e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a la b u s e 。所谓生物修复，就是利用微生物，植 物和动物将土壤、地下水或海洋中的危险污染物降解、吸收或富集的生物工程 技术系统 1 2 1 。王庆仁【1 3 】认为，确切的定义应该是“利用特定的生物( 植物、微生 物或原生动物) 吸收、转化、清除或降解环境污染物，实现环境净化、生态效应 恢复的生物措施”。这一定义应该包括两个方面：一是利用具有特殊生理生化功 能的植物或特异微生物在原位修复污染场所( 土壤或水体) ；二是应用生物处理或 生物循环过程，通过精心设计与合理应用阻断或减少污染源向环境的直接排放。 生物修复可将有机污染物部分或全部转化为微生物躯体或通过代谢作用，转变 成对环境稳定的末端产物。 生物修复根据所用生物体的类型不同一般分为三类：微生物修复、植物修复 和微生物与植物联合修复。 1 2 2 微生物修复 自从1 9 6 5 年j o n e s 和s m i t h 利用微生物处理石油，使石油发生了“物理化 学变化，从而诞生了微生物降解法。作为石油降解的执行者，微生物的种类 是影响土壤石油降解的重要因素。 所谓微生物降解法就是利用微生物来处理含油海水( 淡水) 和土壤，使其 最终完全矿化。即石油产品+ 微生物+ 0 2 + 营养物质一c 0 2 + h 2 0 + 副产品+ 生物量， 特别地，对于烷烃石油产品来说，其生物降解途径如下：烷烃一醇一醛- - - n 旨肪 酸一b 氧化醋酸- - c 0 2 + h 2 0 + 生物量【1 4 , 1 5 l 。己知降解石油的微生物共有7 0 属 2 0 0 余种。其中细菌有2 8 个属，霉菌3 0 个属，酵母1 2 个属。目前对微生物修 复已经有很多相关研究，在微生物修复中有很多影响因素在里面，正是这些影 响因素对微生物的修复起到很大的作用。 1 2 2 1 石油组分 石油烃类化合物可分为4 类，饱和烃、芳香族烃类化合物、沥青质( 苯酚类、 脂肪酸类、酮类、酯类、扑啉类) 、胶质( 吡啶类、喹啉类、卡巴胂类、亚砜类 和酰胺类) 。对各成分的微生物降解率进行比较，认为饱和烃的降解率最高，其 第一章绪论 次是低分子量的芳香族烃类化合物，高分子量的芳香族烃类化合物、胶质和沥 青质则极难降解【i6 1 。微生物可降解所有石油组分，其生物降解性因石油所含烃 分子的类型和大小而异，难易程度为：直链烷烃 支链烷烃 单环芳烃 多环芳烃 杂环芳烃【1 7 , 1 8 l 。在芳香烃部分中，2 环和3 环化合物较容易被降解，而含有5 个 或更多环的那些芳香烃难于被微生物所降解；胶质和沥青则极难被微生物所降 解【1 9 】。c h a i n e a u 等【2 0 】用微生物处理被石油烃污染的土壤，2 7 0 d 后发现，7 5 的原 油被降解；饱和烃中，正构烷烃和支链烷烃在1 6 d 内几乎全部降解；2 2 的环烷 烃未被降解；芳香烃有7 1 被同化；占原油总重量1 0 的沥青质完全保留了下来。 d u a r t e 等【2 l 】从原油污染的土壤中筛选出能够降解萤蒽、菲、芘等多环芳烃的菌株， 其中，3 环化合物较4 环易降解，5 环的也可被降解。相同条件下，石油烃组分的 比例变化影响微生物对单种烃组分的降解能力。混合菌群利用石油烃作为唯一 碳源的能力不仅取决于非饱和烃部分的组成，而且取决于脂肪烃部分的组成。 不同的原油，由于其饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质的含量不同以及饱和烃中 正构烃的含量不同而导致它们具有不同的抗降解性【2 2 1 。石油烃类化合物组成成 分的差异影响其生物降解率。低硫、高饱和烃的粗油最易降解，高硫、高芳香 族烃类化合物的纯油则最难降解。粗油降解后总是留下一些复杂的残留物( 主要 是沥青和胶质) ，但其并不会产生生态毒性作用，因此，对烃类化合物降解的研 究主要还应集中于毒性较强的芳香族化合物。 1 2 2 2 氧气 石油的好氧生物降解过程中需要大量的电子受体，主要是溶解氧和n 0 3 ， 由于石油在水表面形成油膜，氧的传递非常缓慢，在许多石油污染区，供氧不 足成为石油降解的制约因素，尽管在缺氧条件下，厌氧微生物能够利用m n 5 十， f e ”，s 0 4 2 和c 0 2 作为电子受体，但石油降解速率往往降低。在微生物修复中， 很多采用提供电子受体的方式增强微生物的石油降解性。有机物分解的中间产 物和无机酸根可作为最终电子受体。如在缺氧条件下，可以投加硝酸盐和碳酸 盐作为替代的电子受体，比氧更有效地提高降解菌的生物活性。用n 0 3 代替氧 作为最终电子受体降解甲苯、二甲苯和乙苯已获得成功。对于好氧降解，常用 的补充氧的方法包括：土壤深耕，富氧水加注，气泵充氧或注入h 2 0 2 以释放游 离氧。h 2 0 2 在水中的溶解度约为氧的7 倍，每分解1 摩尔能产生o 5 摩尔氧气， 石油污染土壤中加入适量的h 2 0 2 ，其中的一部分h 2 0 2 能直接氧化烃类，另一部 4 第一章绪论 分能及时补充反应时所需的溶解氧，为微生物的生长提供充足的电子受体。 d i b b l e 掣2 3 1 报导，土壤中烃含量浓度达到1 2 5 5 时，土壤的呼吸强度增大，当 烃浓度达到1 0 时，土壤呼吸强度不再增大，烃浓度达到1 5 时，土壤的呼吸 强度下降，这种现象一方面说明较高的烃浓度抑制微生物活性，另一方面说明 土壤溶液中溶解氧量不足以维持高浓度烃的降解。 1 2 2 3 营养盐 微生物代谢需要氮、磷、铁、镁等营养物质的参与才能顺利进行。在石油 污染严重的地方，石油物质为微生物的生长提供了充足碳源，但氮磷盐的供应 成了微生物生长的制约因素，导致微生物对石油烃的降解作用降低。一般认为 c ：n ：p = 1 0 0 ：i o ：i 时最适于烃类的生物降解。m c m i l1 e n l 2 4 】等研究了生物对土壤中 泄漏原油的降解能力，发现当添加肥料的c ：n ：p = - 1 0 0 ：5 ：1 7 ，并为缓慢释放形式时， 效果最佳，并且得出结论：营养比例对烃类生物降解速率的影响既可以是正向 的也可以是负向的。林力【z 5 l 等人分别研究了添加石油烃降解菌和营养对石油烃 降解作用的影响程度，结果表明，接入石油烃降解菌并添加氮、磷营养的处理， 污油的去除率达9 8 8 ，其中石油烃降解菌和氮、磷营养补充对烃降解的贡献率 分别为3 8 和1 4 ，它们明显强化了土壤的自净作用。 1 2 2 4 温度和盐度 温度直接影响了微生物的生长代谢和降解活性，这与石油的降解密切相关。 微生物对石油烃的降解借助于酶的催化作用完成，酶的活性只有在一定温度范 围内发挥作用，不同微生物有不同的最佳适宜温度。温度以两种方式影响油的 生物降解效率：一是温度直接影响烃类降解菌的生长和繁殖以及微生物的种群 构成；二是温度影响油的物理状态和油的化学组成。据报导【2 6 1 ，温度3 0 是微 生物生长和多环芳烃降解的最优温度。 盐度是较复杂的影响因素，当营养盐及温度不是限制因子时，石油烃的生 物降解率随盐度的增大而减小2 7 1 。张从等【2 8 1 报道土壤中汽油的去除率随盐度的 增加而降低。g i r e s s e t 2 9 】等人发现，微生物对有机物的降解随盐度的增加有显著 的降低，这种差别可能是微生物菌种和长期生长环境不同的结果，有些微生物 对盐度的变化具有较强的抗性。k a s t n e r 3 0 1 等发现盐度的增大会抑制土著微生物 及接种的外源微生物对多环芳烃的降解。k a p l e y t 3 1 】等研究了由4 株菌组成的利 第一章绪论 用原油不同组分的混合菌，在盐度为3 0 时接种4 8 h 长势良好，而且在盐度达 到6 0 时仍可以降解原油，但生物体发生了基因的变化。 1 2 2 5p h 值 p h 值影响降解酶的活性，细胞质膜的透性及稳定性，从而影响到石油烃的 降解率，对于某些产生生物表面活性剂的降解菌，p h 值影响发酵液中生物表面 活性剂的聚集形式，使石油烃的分散状态改变，进而影响降解菌与生物烃的接 触状态，最终影响石油烃的摄取。由于绝大部分细菌生长p h 值范围介于6 到8 之间，中性最为适宜，真菌适宜的p h 值环境为偏酸性，生物修复的研究和应用 也多集中在这个范围。如果实际环境为偏酸性或偏碱性时，通常用酸碱缓冲液 或中性调节剂等调整p h 值，这样可以明显提高生物降解的速率。在酸性土壤的 治理中，价格低廉的石灰常常被用于提高p h 值，但要注意防止影响氮磷等元素 的生物可利用性。 1 2 2 6 表面活性剂 在石油污染的生物处理中，为达到高效的生物降解，加入表面活性剂可以 减少石油物质与水溶液间的界面张力，增加石油的溶解性，使微生物和石油更 有效的接触，加速石油的生物降解。生物表面活性剂以其可生物降解，无毒害， 结构多样性和对环境具有温和型等优点成为研究热点，不同微生物往往产生不。 同结构的表面活性剂。许多研究表明，生物表面活性剂对生物降解有很好的促 进作用。高士祥掣3 2 l 使用表面活性剂清洗法对芳香烃污染土壤进行修复作用研 究，结果发现，表面活性剂对土壤中芳香烃类化合物有很好的去除效果。 1 2 2 7 共代谢作用 共代谢是指生长底物和非生长底物共酶。生长底物是能被微生物作唯一碳 源和能源的物质。共酶是指一些污染物( 非生长底物) 不能用于微生物的唯一 碳源和能源，而只能在生长底物( 如甲烷) 被利用时，通过微生物产生的酶被 转化为不完全氧化的产物，而这些不完全氧化产物能被其它微生物利用并彻底 降解。因此，提供提高共代谢底物促使微生物产生酶将有利于难降解污染物的 去除。研究结果表明许多微生物能以土壤中低分子量的多环芳烃化合物( 双环 或三环) 作为唯一的碳源和能源，并将其完全无机化，但是共代谢更能促进四 环或多环高分子量芳烃的降解d 引。 6 第一章绪论 1 2 3 植物修复 植物修复是一种主要利用植物去除和削减污染物的环境治理技术。它是利 用植物原位处理污染土壤的方法，是种很有希望的、可有效和廉价处理某些 有害废物的新方法。植物除了直接吸收、固定、分解污染物外，通常只是间接 地参与污染物的分解，它通过对土壤中的细菌、真菌等微生物的调控来进行环 境的修复。因此，植物对环境的修复过程是由高等植物、真菌、细菌等微生物 共同组成的整体来完成的。 植物修复的方式有3 种：植物提取( p h y t o e x t r a c t i o n ) 。植物吸收积累污染物， 待收获后才进行处理。收获后可以进行热处理、微生物处理和化学处理【3 4 1 。 植物降解( p h y t o d e g r a d a t i o n ) 。植物及其相关微生物区系将污染物转化为无毒物 质。植物稳定化( p h y t o s t a b i l i z a t i o n ) 。植物在同土壤的共同作用下，将污染物固 定，以减少其对生物与环境的危害。植物主要通过三种机制去除环境中的有机 污染，即植物直接吸收有机污染物；植物释放分泌物和酶；刺激根区微生物的 活性并强化生物转化作用。 植物修复的效果受多种因素的影响，如污染物的种类、理化性质( 如疏水 性、解离度) 、浓度等直接影响根系对污染物的吸收作用，污染物分子量的大小 也影响其渗透进入植物细胞的速度。此外，土壤类型及土壤理化性质如养分状 况、氧化还原电位、土壤温度、湿度、p h 值、土壤质地等也会通过影响微生物、 植物生长及污染物状态而对修复效果产生影响。 近年来，关于石油类污染物植物修复研究报道增多。孙铁衔和宋玉芳等【3 5 】利 用苜蓿草进行了野外盆栽实验，研究植物对土壤石油和多环芳烃生物修复影响 及调控作用，结果表明土壤中的多环芳烃降解率明显高于对照，说明植物根际 对降解有作用。r e i l l e y 3 6 】等利用酥油草( 屁c ，阳u r u n d i n a c e as c h r e b ) 、紫花苜蓿 ( m e d i c a g os a t i v a ) 、苏丹草( s o r g h u mv u l g r e ) 和三叶草( p a n i c u mv i r g a t u m 三) 等4 种植物对石油污染土壤中p a h s 的降解进行了研究，发现用1 4 c 示踪的葸和芘在种 植植物时，其降解率都有显著提高。m a r t i n e z z 等【3 7 】用一种墨西哥植物沙草 ( c y p e r u sl a x u $ ) 处理石油污染土壤已进入中试阶段，他们认为在一定浓度范围 内植物修复能取得很好效果，但如果浓度过高，就必须进行预处理。d o w t y 等t 3 8 】 筛选出2 种植物( p h e m i t o m o n 和s 1 a n c i f o l i a ) 用来处理湿地石油泄漏污染，发现前者 短期处理效果好，而后者长期效果更好。利用植物修复土壤中的烷烃和单环芳 香化合物b t e x ( 苯、甲苯、乙苯及二甲苯的异构体) 比较成功的是杨树、柳树和 7 第一章绪论 紫花苜蓿掣3 9 4 1 1 。杨柳科的植物，尤其是杨树属，可大量去除土壤有机污染物【4 2 】。 经基因改良的紫花苜蓿可耐受高浓度的原油污染【4 0 1 。l i n 等【4 3 】研究了沼泽植物 s p a r t i n aa l t e r n i f l o r a 和s p a r t i n a p a t e n s 对不同浓度石油污染的降解情况，表明在一 定浓度范围内，植物不仅可以生存良好，而且可以5 8 5 的速度降解污染物。 s c h w a b 掣4 4 】发现黑麦草( l o l i u mp e r e n n e ) 与大_ 豆_ ( g l y c i n e m a x ) 轮作之后，污染土壤 中总石油烃含量明显下降。 植物修复的缺点是修复过程比物理化学修复过程缓慢，因此比常规治理( 挖 掘、场外处理) 周期长、效率低。对土壤肥力、气候、水分、盐度、酸碱度、排 水与灌溉系统等自然和人为条件有一定要求【4 5 】，植物受病虫害袭击时会影响其 修复效果。此外，植物修复受污染物浓度的限制，只有在植物能承受的浓度范 围内，植物修复才能进行。当然，任何技术都有其优势和不足之处，从其诸多 优点看，植物修复是颇有发展潜力的，如能通过基因改良提高其降解和适应能 力，并与其他方法联合使用，必定能在污染土壤修复中发挥重要作用，其发展 和应用前景己被世人瞩目 4 6 1 。 1 2 4 石油污染土壤的植物一微生物联合修复 在植物微生物联合生物修复中，降解性取决于有机污染物通过植物一微生物 系统吸收和代谢能力，利用植物及其根际微生物共存体系净化土壤中有机污染 物。植物微生物联合体系能促进有机污染物的快速降解、矿化。其基本原理为： 1 ) 植物根区分泌物刺激了细菌的转化作用；2 ) 植物还可为微生物提供生存场所 并可转移氧化，使根区的好氧转化作用能够正常进行。 植物微生物联合修复中起主导作用的是根际，1 9 0 4 年德国微生物学家 h i l m e r 首先提出“根际 概念，主要研究根际微生物效应。植物生活期间特别 是苗期，通过根系向土壤分泌糖、有机酸、氨基酸、维生素等有机化合物；随 根系发育、死亡，脱落的根系、根毛和皮层组织亦在根周聚集，这样根际土壤 保持湿润，根际土壤尚有良好的团粒结构。根际呼吸和有机物质分解对氧的消 耗，根周氧压变低，还原电位高。上述各项条件改变，形成了根周的特殊生态 环境，称为根际。根际范围随植物种类及土壤气候条件有所不同。影响显著的 仅有2 - - 一3 m m ，影响距离达2 3 c m ；距根愈远，根际效应愈小，生态条件愈接 近于一般土壤【4 7 1 。a n d e r s o n 等【4 8 】的实验表明，植物以多种方式帮助微生物转化， 根际在生物降解中起着重要的作用。根际可以加速脂肪烃类、多环芳烃类的降 8 第章绪论 解。植物根系微生物密度增加，多环芳烃的降解也增加。植物为微生物提供生 图l - 1 植物和微生物联合修复原理 降解污染物 存场所并可转移氧气使根区的好氧转化作用能够正常进行，这也是植物促进根 区微生物矿化作用的一个机制。根际微生物群提供的外部保护对微生物和植物 双方是互利互惠的。微生物受益于植物的营养供给，主要表现在根周围( a o 根际) 土壤里微生物的种类和数量上。反过来，植物受益于由根圈微生物伴随的土壤 中有机有毒物质的脱毒，具体表现为对作物的生长及产量的影响。这样扩大了 微生物与土壤的接触面积和作用时间，同时也增强了植物根系的吸收作用，特 别是有利于难降解有机物的分解。几乎所有的植物都能与一定种类的细菌、放 线菌或( 和) 真菌建立这互惠共生关系，形成互惠共生体( 相互的共栖) 4 9 】。 根分泌物的产生由于植物根系生活在植物土壤微生物等环境的特殊微生 态系统中，在植物代谢过程中有部分物质以根分泌物形式释放到根际。植物在 整个生长期间进行着活跃的新陈代谢活动，根系不仅从环境中摄取养分和水分， 同时也不断地向生长介质中分泌大量的低分子有机化合物( 如糖类、有机酸、 氨基酸、酚类化合物等) ，为根际微生物提供大量的营养和能量物质，使土壤微 生物的活性和生态分布发生改变，从而产生明显的根际效应。植物提供了根区 微生物生长的生境( h a b i t a t ) ，可向土壤环境释放大量分泌物( 糖类、醇类和酸 类等) ，其数量约占年光合作用产量的1 0 2 0 【5 0 】，细根的迅速腐解也向土壤 中补充了有机碳，这些都加强了石油烃的微生物降解速率。而微生物改善了植 9 第章绪论 物对水分和营养物质的获得，还可保护植物免受毒性物质侵害的作用d 。 植物释放促进化学反应的根际分泌物和酶，刺激根际微生物的活性和生物 转化作用。植物可释放一些物质到土壤中，以利于降解有毒化学物质，并可刺 激根区微生物的活性，而且还为有机污染物共代谢提供大量的共代谢基质【5 0 1 。 目前对植物和微生物联合修复技术已经有了一些研究，利用苜蓿草与微生 物修复p a h s 和矿物油污染土壤的研究表明，在植物生长条件下，土壤微生物降 解功能明显增强【5 。而一项以水稻为供试植物修复湿地土壤中矿物油和p a h s 的 研究表明，真菌和细菌接种量在不同污染水平上与矿物油和多环芳烃降解率存 在最佳配比关系。c a r m a n 等利用柳树修复威斯康星州一块被2 撑柴油污染的土壤， 主要是利用树木根部的根际微生物促进石油烃的生物降解，2 4 周后，4 0 - 、一9 0 的柴油被降解。刘鹏等利用高效石油降解菌结合种植大豆、碱草等植物对石油 污染土壤进行联合修复，1 3 5 d 后石油烃的降解率达6 3 6 5 - - 8 3 2 6 ，同时发现 根际土壤的石油烃含量明显低于非根际土壤，研究表明，植物可以促进根际微 生物的繁殖及对污染物的分解转化，进而提高修复效率1 5 2 1 。 最近一些研究发现，土壤微生物本身能降解多环芳烃，但降解能力较弱， 在植物存在条件下，其降解率能提高2 - 4 7 ，且投加特效降解菌对葸、芘和 苯等的降解有明显促进作用。植物根际对表层土壤有毒有机污染物( 女i i p a h s ) 的生物修复可能起重要作用。孙铁珩等利用苜蓿草进行了菲降解的室外盆栽研 究，结果表明种植植物的土壤根际中菲的降解率明显高于对照的土壤，且根际 土壤中的微生物数量明显高于非根际土壤，说明土壤中菲的降解是在植物及根 际微生物的共同作用的结果【3 4 l 。b i n e t 等利用黑麦草对增强3 6 环p a h s ( 葸、 菲、萤葸、苯并 a 】萤葸、二苯并 a ，h 】葸) 的降解进行了研究。研究表明，黑麦 草根际对降解包括5 环和6 环的大部分p a h s 有很大的潜力，特别是对p a h s 污 染后进行陈化处理的土壤尤为明型弱j 。 植物和专性降解菌联合修复过程中，降解菌的投入量和施肥量对降解效果 有很重要的作用。真菌和细菌的接种量在不同污染水平上与矿物油和多环芳烃 降解率存在最佳配比关系，过大或过小的外来接种不但不能产生最佳的清洁效 果，反而会使土著微生物的降解能力下降，使污染物去除率降低。为外来菌提 供营养可以提高其存活率和降解率，实验表明，有机肥含量与多环芳烃的降解率 呈正相关，有机肥主要对3 环多环芳烃的降解起作用，对4 、5 环多环芳烃的降 解并未产生有效作用。宋玉芳等研究有相同的效果，并且得到有机肥与微生物 l o 第一章绪论 数量的关系，有机肥量与苜蓿草根际土著真菌、细菌数量明显呈正相关，但仅 与水稻根际土著细菌数量呈明显正相关【5 4 】。引入高效降解菌或根际协同菌群可 以提高植物的修复效率，但要达到预期效果，需要对植物微生物、微生物微生 物之间的相互关系有深入了解，以便进行有效调控。 1 2 5 国内外研究现状 国外对石油污染土壤的修复，已经将植物修复和微生物修复用于场地修复， 植物微生物联合修复效果与根际土壤中微生物活性有很大关系，对于根际微生 物的研究有利于植物和微生物修复得到更广泛的利用。 国内对石油污染土壤的植物修复中多采用黑麦草、高羊茅、紫花苜蓿、披 碱草和水稻、玉米、大豆等植物，欧阳威等进行了石油污染土壤在外源微生物 菌剂和高羊茅协调作用下的强化修复试验，高羊茅草坪能够提高微生物进一步 降解的能力，在直接铺草坪的情况下，去除率可以达到5 1 6 2 ；在播种高羊茅 草种，形成新嫩草坪的情况下，去除率为4 8 一- 5 4 【5 5 1 。 目前国内外对石油污染土壤修复过程中对微生物多态性的分析有了一些研 究，j e n n i f e rl k i r k a 等对高羊茅和紫花苜蓿修复石油污染土壤中微生物的群落结 构和形态变化做过研究【5 6 】。佘跃惠使用p c r d g g e 对原油储层微生物的群落结 构和微生物多样性进行研究，对不同地方的微生物群落的多样性进行了相似度 的比较并鉴定了部分群落成员1 5 7 j 。 1 2 6 生物修复技术的不足 生物修复技术虽然已经取得很大的发展，但由于受生物特性的限制，其还 存在许多的局限性1 5 引。 ( 1 ) 微生物不能降解石油中的所有污染物，污染物的难降解性、不溶解性 及污染物土壤腐殖质和泥土结合在一起常使生物修复难以进行。 ( 2 ) 一些低渗透性土壤往往不宜采用生物修复技术。 ( 3 ) 石油的成分复杂，一般来说，一种微生物只对特定的化合物起作用， 而且化合物状态稍有变化可能就不被同一种微生物酶所破坏。这对于投加微生 物的要求很高，不易掌握。 ( 4 ) 微生物活性易受温度和其他环境条件的影响。 第一章绪论 1 2 7 生物修复技术的发展前景 污染土壤的生物修复技术虽然已取得一些成果，但仍很不完善，主要是处 理后污染物的残留不能符合环境指标要求。还需要在以下几个方面进行深入研 2 酬5 9 ，6 0 】 u o ( 1 ) 共存物质( 如重金属) 对微生物降解的抑制效应及外源物质( 如表面 活性剂) 对微生物的促进效应。 ( 2 ) 高分子有机污染物降解过程中的共代谢机理。 ( 3 ) 通过遗传基因工程构建高效降解菌。 ( 4 ) 生物降解潜力的指标与生物修复水平的评价。 ( 5 ) 生物修复技术的环境风险水平及其评价。 ( 6 ) 生物修复过程中的基因调控机制。 第三节分子生物学技术在石油污染土壤中微生物生态多样性的应 用 近年来，基因组学和现代分子技术的成熟逐渐渗透到有关生命科学的整个 领域，也为微生物生态学提供了新研究方法和机遇。国际上大量的研究和开发 实践证明，分子微生物生态学方法不受微生物是否可以分离培养的限制、不受 微生物在实验室中是否活泼的限制，可以快速、准确、全面和真实地分析复杂 的微生物群落结构。因此，分子生物学方法的发展为研究石油微生物群落提供 了一个新的工具。 土壤是由固相、液相和气相共同组成的三相体系，土壤固相组成及性状复 杂，存在于其中的生物群落亦具有高度的不均一性和波动性，土壤生态体系的 复杂性加大了生物修复的难度。具有高效代谢污染物能力的微生物接入污染土 壤中，受污染体系温度、水含量、p h 值、营养物质供给等因素的不规律剧烈波 动，以及土著微生物竞争作用的影响而无法生存，这是制约生物修复技术效率 的根本原因1 6 1 , 6 2 】。因此，以分子生物学技术为基础，研究开发在复杂污染体系中 快速定量分析具有高效代谢污染物能力的微生物及微生物群落变化的方法，用 于指导生物修复的理性设计和过程调控是环境生物修复技术的重要研究方向。 目前微生物分子生态学研究的焦点集中在具有保守序列的1 6 s