浅析高效液相色谱在食品分析中的应用.doc

目 录摘要关键词引言1高效液相色谱的简介1.1 HPLC的分类1.2 HPLC的特点1.2.1 HPLC与经典液相色谱法的比较 1.2.2 HPLC与气相柱色谱（GC）的比较1.3 HPLC的应用范围1.4 高效液相色谱仪1.4.1流动相输送统1.4.2进样系统1.4. 3分离系统1.4. 4检测记录数据系统2 HPLC在食品分析中的应用 2.1 HPLC在糖类分析中的应用 2.1.1 低分子糖的分析 2.1.2 低聚糖的分析 2.1.3 多糖的分析 2.2 HPLC在氨基酸分析中的应用 2.3 HPLC在维生素分析中的应用3 HPLC在食品检测中的应用 3.1 HPLC在食品添加剂检测中的应用 3.1.1 防腐剂检测中的应用 3.1.2 甜味剂检测中的应用 3.1.3 食用色素检测中的应用 3.2 HPLC在霉菌毒素检测中的应用 3.3 HPLC在农药残留检测中的应用总结浅析高效液相色谱法在食品分析与检测中的应用摘要 高效液相色谱法（HPLC）是1964-1965年开始发展起来的一向快速新颖的分离分析技术。作为化学分离分析的一种重要手段，已经应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、生物大分子、表面活性剂、抗氧剂等的分离分析。在化学工业、资源环境、食品安全及临床等领域得到广泛应用，目前在生命科学中也显出重要地位。该文简介了高效液相色谱法及高效液相色谱技术在食品分析（如糖、氨基酸及维生素等的分析）和检测（如食品中的添加剂、霉菌毒素、农药残留等的检测）中的应用。近年来HPLC在食品检测和分析上应用飞速发展。HPLC法已增补进中华人民共和国食品检测国家标准方法，大约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。关键词 高效液相色谱法（HPLC） 食品分析与检测 应用引言 色谱法又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱技术有许多优点：分离效率高，应用范围广，分析速度快，样品用量少而且灵敏度高。在食品分析中应用较广泛的是高效液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术；20世纪70年代末，我国高效液相色谱技术开始应用在食品卫生领域；20世纪90年代后期，国家标准中开始将HPLC法列为检测食品中的营养成分、添加剂、有害物质等的国标方法。1、高效液相色谱的简介高效液相色谱简称HPLC，又称现代液相色谱法。该法是在经典液相色谱法的基础上，吸收了气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的，既有经典液相层析的功能，又有气相色谱的特点，在技术上采用了高压、高效固定相和灵敏度检测器，使之发展成为高分离速度、高分辨率、高效率、高检测灵敏度的液相色谱法。HPLC是近年来迅速发展起来的一项新颖的分离技术，不仅适用于很多不易挥发，难热分解物质（如蛋白质，肽类，氨基酸及其衍生物等）的定性定量分析，而且也适用于上述物质的制备和分离。HPLC法由于兼备液相和气相两种色谱分析方法的优点，近年来在食品检测和分析上应用并飞速发展。1.1、HPLC的分类HPLC按照样品组分在固定相和流动相分离过程的物理化学原理分类，可分为：一、吸附色谱 固定相是固体吸附剂，流动相为不同极性的溶剂。 二、分配色谱 固定相是（载体固定液），流动相为不同极性溶剂。三、离子色谱 固定相：高效微粒离子交换剂，流动相：具有pH值的缓冲溶液。 分离原理：依据离子型化合物中各离子与离子交换剂上的表面电荷基团的可逆交换能力的差别而实现分离。四、体积(空间)排阻色谱 固定相：具有化学惰性的多孔性凝胶，流动相：以水作流动相的体积色谱，称凝胶过滤色谱；以有机溶液做流动相的体积色谱，称凝胶渗透色谱。 分离原理：根据固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。五、亲和色谱 固定相：在不同的基体上，键合多种不同特性的配位体，流动相：不同pH值的缓冲溶液。 分离原理：依据生物分子(如氨基酸、肽、蛋白质等)与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。11.2、HPLC的特点1.2.1、HPLC与经典液相色谱法的比较经典液相色谱法的致命弱点是柱效低、分离时间长、难以解决复杂混合物的分离，与气相色谱比较有很大的差距。HPLC与经典液相柱色谱法的分析原理基本无本质差别，但经三十多年的发展，HPLC既可以在分析速度、分离效能、检测器灵敏度和操作的自动化程度等方面与气相色谱分析法相媲美，同时又保持了经典液相色谱对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多等优点，因此，广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、环境监测、石油化工等领域。其特点有： (1)分离效能高。由于高效微粒固定相的使用，使理论塔板数可达到103104块/m，远远高于GC的103左右(填充柱)。(2)选择性高。因为流动相可与样品组分发生相互作用，所以，通过改变流动相的组成，可以达到控制和改善分离过程选择性的目的。因此，HPLC不仅可以分析不同类型的有机物及其同分异构体，而且已在合成药物和生化药物的生产与控制分析中发挥了重要作用。(3)检测灵敏度高。HPLC中应用的检测器大多数都有较高的灵敏度。高压输液泵的使用，使HPLC分析一个样品仅需几分钟至几十分钟。1.2.2、HPLC与气相柱色谱法(GC)的比较HPLC是在GC高速发展的情况下发展起来的。他们之间在理论上和技术上有许多共同点，主要有：一、色谱的基本理论是一致的；二、定性定量原理完全一样；均可应用计算机控制色谱条件和色谱数据的处理程序，自动化程度高。然而，HPLC与气相柱色谱法(GC)相比较，完全有自己独特的几点优势，主要有：(1) GC的分析对象仅限于蒸汽压低、沸点低的样品(仅占有机物总数的20%)，不适于分析高沸点有机物、高分子化合物、热稳定性差的有机物及生物活性物质。而HPLC不受此限制，能对80%的有机物进行分离与分析。(2)GC流动相为惰性气体，不能与待测组分发生作用。HPLC流动相选择余地大，可与待测组分发生作用，而且通过改变流动相的组成，可改善分离的选择性(相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数)。(3)GC通常在高温下进行，HPLC可以室温下进行分离与分析。(4)非破坏性检测器在HPLC中的使用，可使样品回收(特别是少量珍贵样品)或样品的纯化制备成为可能。HPLC与GC相比，虽有其特定的优势，但也有一定的局限性：(1)在HPLC中，所用流动相不止一种(多种)，因此其分析成本高，且易起环境污染；当进行“梯度洗脱”操作时(相当于GC中的程序升温技术)，比GC的程度升温操作要复杂的多；(2)HPLC目前还缺少像GC中的通用型检测器(如TCD、FID);(3)HPLC不能替代GC。当要求柱效高达10万块理论塔板数以上时，只能用GC中的毛细管色谱柱；(4)在200kPa1Mpa柱压下易分解、变性的生物活性的生化样品，不易用HPLC分析。所以说，任何分析方法都不能十全十美，只有掌握了它的特点，才能更好地利用它。1.3、HPLC的应用范围HPLC不受试样挥发和热稳定性的限制，非常适合分析高沸点、不易挥发的、受热不稳定、易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。涉及石油化工、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物的分离与分析等，约占全部有机物的80%。其余20%的有机物(含永久性气体、易挥发低沸点及中等分子量的化合物)只能用GC分析。1.4、高效液相色谱仪HPLC仪器的工作过程为：高压泵将贮液器(或槽、罐)中的流动相溶剂经进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出(通常要回收)。当注入待测样品时，流经进样器的流动相将样品各组分带入色谱柱中进行分离，分离后的各组分依一定的顺序进入检测器，检测器产生的信号由记录仪记录下来，最后形成液相色谱图。因此，HPLC仪可分为四个主要组成部分，即：流动相输送系统、进样系统、分离系统和检测记录数据处理系统。1.4.1、流动相输送系统包括贮液槽和高压泵。贮液槽常使用1L锥形瓶，在连接到泵入口处加一个过滤器，贮液槽还常配备抽真空机吹入惰性气体装置。高压输液泵应该具备密封性好、输出流量恒定、压力平稳、可调范围宽、便于更换溶剂及耐腐蚀等条件。常用的输液泵有恒流泵和恒压泵两种，而恒流泵用的较多(因为它的输出流量能始终保持恒定，与色谱柱引起的阻力大小无关)，而恒压泵用的较少。恒流泵又分为机械注射泵和机械往复泵，后者用的最多。1.4.2进样系统进样系统包括进样口、注射器、六通阀、和定量管等，它的作用是把样品有效的送入色谱柱。由于HPLC色谱柱比GC色谱柱短的多(约530cm)，所以，引起色谱峰峰形变宽的因素以柱外因素为主(即：进样系统、连接管道及检测器中存在的死体积)。而柱外展宽(色谱柱外因素引起的峰形变宽)又分柱前和柱后展宽，以进样系统所引起的柱前展宽为主要因素。为了减少影响，对进样口要求死体积小、没有死角，能够使样品像塞子一样进入色谱柱。1.4.3分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温装置、保护柱和链接阀等。分离系统好坏是色谱分析的关键。色谱柱是其核心部件之一。通常用45mm，530cm长度的不锈钢管作高压色谱柱，内装510m的全多孔型高效微粒固定相。21.4.4检测记录数据处理系统 检测数据处理系统包括检测器、记录仪、和微型数据处理机。用于HPLC仪的检测器有两类，一类是溶质型检测器，它仅对被测组分的物理或化学特性有响应，属于此类的有：紫外、荧光及电化学检测器等。另一类是总体检测器，它是对试样及洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于此类的有：示差折光、电导等检测器。3在实际工作中, 应根据具体情况来选择适宜的检测器。而在HPLC仪器的常规分析中，紫外检测器用的最多。2HPLC在食品分析中的应用2.1 HPLC在糖类分析中的应用糖是由碳、氢、氧3种元素组成的有机化合物，亦称碳水化合物，根据其分子结构分为单糖、双糖、低聚糖和多糖。食品分析工作者对糖分析方法的要求是既要适用于简单食品，又要适用于复杂加工的食品，而且测定要准确、迅速、可靠。HPLC法测定糖具有明显的优势，并得到了广泛的应用。糖的HPLC测定法主要有两类。一类采用阳离子交换剂或者凝胶柱，以水、醋酸钙溶液或稀酸等作为流动相。第二类是使用化学键合固定相，流动相为乙腈水。2.1.1 低分子糖的分析低分子糖的分析，是指单糖到四糖的分析，食品分析专家要求能准确地测定部分或全部果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。果糖、葡萄糖、蔗糖的分析可以提供蔗糖转化的程度及转化糖在产品中的含量;乳糖常作为脱脂奶粉等乳制品的一个主要指标;蔗糖则是最常见的食品成分，这些都是HPLC分析食品中低分子糖的典型例子。用氨基键合相硅胶柱进行低分子糖的分析时，其典型的色谱条件是:柱长1525cm，流动相为乙腈溶液（乙腈2080%），检测用示差折光检测器（RID），进样量通常为10100L，分析时间一般在20min以内3。2.1.2 低聚糖的分析低聚糖的分析与上述低分子糖的分析极为相似，同样可用氨基健合柱，但是流动相中水的比例要增加到4060%，分析时间较长，大约需要30min。近来国内已有不少文献报导。陈洪用HPLC法测定了饴糖中的低聚糖，发现饴糖中的低聚糖以麦芽糖为主，含量为2539%，另外还含少量的葡萄糖、麦芽三糖和麦芽四糖，葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的最低检出限在微克级。还有文献报导了用高效液相色谱法分析蔗果低聚糖合成液和测定异麦芽低聚糖的组分3。2.1.3 多糖分析多糖的分析，主要是用于分离纯化及纯度和分子量的测定。过去常用的测定方法有超速离心法、高压电泳法、渗透压法、粘度法和光散射法等。使用这些方法，操作麻烦，结果误差很大。七十年代以后，由于耐高压合成凝胶的出现，HPLC已可用于多糖纯度和分子量的测定以及制备多糖的分离，这样效果更好。2.2 HPLC在氨基酸分析中的应用测定氨基酸的标准方法是利用与茚三酮的显色反应和离子交换色谱法分离。但是，Bakyer，E于1976年用HPLC法分析氨基酸是利用衍生反应，使之转化成具有强荧光衍生物检测的浓度要比茚三酮反应低45个数量级。所以该法要比气相色谱法要灵敏。HPLC法的操作条件是采用双柱系统，柱1用梯度洗脱，柱2用恒定洗脱。荧光检测DNS氨基酸的激发波长为340nm，发射波长为510nm。可用正相色谱分离，在1毫升/分钟流速下，柱温65时可得到18种氨基酸的分离图谱。也可用反相色谱分离，在1.5毫升/分钟流速下，柱温45可得到17种氨基酸的分离图谱。检测灵敏度和操作时间比标准方法都有很大提高。在该方法研究的基础上，有人先后把它用于分析粮食中的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸。JJWarthesen和PLLramer1987年报道用HPLC法测定强化小麦粉中游离的赖氨酸。他们先从强化的面粉或面包中提取游离赖氨酸，用三氯醋酸沉淀蛋白质，离心后取上清液用0.1M硼酸缓冲液调PH至9.0，最后定容到一定量。接着进行丹酰反应，让赖氨酸提取液与氯化丹酰丙酮液于40避光条件下反应生成二丹酰赖氨酸衍生物。二丹酰赖氨酸衍生物通过十八烷基键合相柱，以乙腈/0.01MNa2HPO4（2：5）为流动相，在1.5毫升/分钟流速下于8分钟后分离出来，用紫外检测器254nm外测。WRPeterson等人以大豆、酪蛋白、面筋、玉米为例，提出用HPLC法测定食品蛋白质中总赖氨酸和有效赖氨酸的分析方法。关于赖氨酸的测定方法与前者基本相同，只是增加一个用6.0NHCL水解的步骤，并把1.0毫克分子氯化丹酰丙酮液浓度提高到150毫克分子。在有效赖氨酸（具有游离氨基的赖氨酸，若氨基发生变化，会使赖氨酸失去营养强性）的测定中，又用HPLC法与氟代二硝基苯分光光度法进行了比较，其分析结果没明显差异。而且HPLC还比后者少了一个样品净化过程。色谱分离二硝基苯赖氨基仍用十八烷基键同相柱，乙腈/0.01M醋酸缓冲液（20：80）（PH4.0）为流动相，于紫外可见光检测器436nm处测定4。分析强化食品中游离蛋氨酸的HPLC法是OkeefeLL和WarthesenJJ提出的，用1.0%甲醇从强化食品中提取DL-蛋氨酸，再用三氯醋酸沉淀蛋白质，经过滤用5NNAOH把滤液PH调至9.5，用水定容后取部分提取液进行丹酰反应。蛋氨酸的丹酰衍生物与其氯化物通过十八烷基键合相柱，乙腈/0.01MNa2HPO4（1：4 ，PH7.9）作流动相，在2毫升/分钟流速下得到分离，于紫外检测器254mn处测定。用HPLC法测定食品中的色氨酸是利用分子本身的荧光，直接通过荧光计检测，激发波长为283nm，发射波为343nm。用多孔硅胶柱分离，PH3.8的醋酸缓冲液作流动相，在2.5毫升/分钟流速下获得大麦水解物的色氨酸分离图谱。检测范围是810-927010-9克。在这项研究中，用含有麦芽糊精的6MNAOH水解蛋白质。麦芽糊精作抗氧剂，可提高某些酶（溶菌酶，胰凝乳朊酶）中色氨酸的回收，但对菜籽粉中色氨酸的回收没影响。同时还证明蛋白质水解时间对色氨酸回收的影响。2.3 HPLC在维生素分析中的应用维生素C是一种对人体十分重要但人体自身又不能合成的一类重要化合物。由于它具有抗坏血酸的生理功能，又名抗坏血酸，若严重缺乏会引起坏血病。维生素C还可参与体内氧化还原反应，具有解毒的作用。30 年代时，维生素C就被广泛用于增加机体对传染病的抵抗力，近年的研究表明维生素C可预防癌症，并对肝炎、肝硬变有疗效。它可促进胶原蛋白抗体的形成，因胶原蛋白能包围癌细胞，维生素C具有抗癌作用，因它能参与神经介质、激素的生物合成，同时具有预防感冒、增强机体免疫力等功能5。人体自身不能合成维生素C，必须从食物摄取。维生素C广泛存在于新鲜水果和蔬菜中，测定方法一般有比色法、荧光分光光度法、化学滴定法等。由于上述方法操作烦琐，近年来多采用高效液相色谱法测定6。对于维生素的分析，除了个别几种维生素（维生素B6、B12和维生素H等）必须采用微生物法进行测定外，大多数维生素均可采用液相色谱法进行分析。水溶性维生素（B1、B2、C）的测定，将样品用酸消化后，用酶分解蛋白质，然后用溶剂提取出维生素，而脂溶性维生素（A、K、E）的测定则将食品进行皂化处理后，提取不皂化物，然后再从不皂化物中将维生素萃取出来，预处理后的两类维生素，通过液相色谱紫外/可见检测器在各自所固有的波长条件下进行定量测定。高效液相色谱法根据不同的要求，所选择的固定相、流动相、流速、检测器和检测波长都不相同。多数方法采用荧光检测器、电化学检测器、紫外检测器或在检测中变换检测波长。李学梅测定保健食品中维生素C时，选用的色谱条件为EclipseXDBC18 416mm250mm 5m柱、C18416mm20mm 5m预柱，流动相为甲醇：0102mol/L2。3、HPLC在食品检测中的应用3.1 HPLC在食品添加剂检测中的应用食品添加剂，指为改善食品品质和色、香、味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品的人工合成或者天然物质。主要分为防腐剂、甜味剂、天然或人工合成色素、抗氧化剂、香精香料等。天然食品添加剂一般对人体无害，但目前所使用的绝大多数是化学合成添加剂，有的具有一定的毒性，如不加以限制使用，对人体健康会产生危害。因此，测定食品中添加剂的含量以控制其使用量，对保证食品质量，保障人民健康具有十分重要的意义。3.1.1 防腐剂检测中的应用防腐剂可以抑制食品中微生物的繁殖或杀灭之，防止食物腐败，保持食品的鲜度和良好品质。因其具有毒性小的特点，故国标法中允许一部分食品中加入少量的防腐剂。在我国，目前食品生产中使用的防腐剂绝大多数都是人工合成的，使用不当会有一定的副作用；有些防腐剂甚至含有微量毒素，长期过量摄入会对人体健康造成一定的损害。而且随着人们对绿色食品的要求不断提高，食品中防腐剂含量的测定就显得尤其重要。苯甲酸和山梨酸是食品中最常使用的两种防腐剂。对于它们的分析过去常用分光光度法和气相色谱法进行, 但要经过繁杂的预处理操作。近年来发展了高效液相色谱法只需经过简单的处理, 就可直接进行测定。我国秦皇岛卫生检验所的赵惠兰等报导了用高效液相色谱法快速测定饮料中苯甲酸、山梨酸的方法7。他们将饮料过滤后直接注入液相色谱系统。1020min 可同时测定这两种防腐剂及糖精钠的含量。该法的色谱条件是：以uBandapak C18柱为分析柱，含有0.02M醋酸胺的甲醇水（35：65）溶液为流动相, 洗脱速度1ml/min,在 254um的紫外检测器进行检测。该法的回收率97%。标准差为0.29，变异系数为0.038。武汉市产品质量监督检验所的周胜银、李增也报导了用高效液相色谱法测定酱油及软饮料类样品中防腐剂的方法8。3.1.2 甜味剂检测中的应用天然甜味剂有蔗糖、葡萄糖、甘草酸钠盐等，人工甜味剂有糖精及其钠盐、环已基氨基磺酸钠等。而糖精钠价格低廉，添加方便，故使用面很广。但如不严格控制添加量，过量会对人体造成危害。因此必须对市售食品中添加剂糖精钠的情况进行监测。黎其万等3采用WatersNova-parkC18色谱柱，0.02mol/L乙酸铵甲醇溶液为流动相，柱温30，流速1.0mL/L的色谱条件测定油浸酱菜中的糖精钠，测定结果是相关系数为0.9982，回收率90.6%105.2%，相对标准偏差4.6%5.8%。文红4采用高效液相色谱法测定了固体样品肉制品中的糖精钠含量，所得结果的相关系数为0.9987，回收率97.5%102.1%，相对标准偏差1.58%2.05%。刘思洁等5建立了一种可以同时测定饮料中糖精钠、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜的方法，采用C18反向柱，以乙腈-0.02mol/L硫酸铵溶液（595）为流动相，在214nm波长处检测。结果表明以上三种甜味添加剂在饮料中最低检出限为4g/ml。3.1.3 食用色素检测中的应用为了改善食品的感官性状，允许在食品中添加一定限量的食用色素。食用色素可分为食用天然色素和合成色素，天然色素来源于植物色素和动物色素，一般较为安全。但合成色素大都有慢性毒性或致癌性，必须严格控制使用种类及含量。王红梅6等为建立一种简便并可同时测定肉制品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的方法，肉制品经脱脂、乙醇+氨水（v/v）=70+30超声波振荡提取，过滤，采用HPLC系统以20mmol/L乙酸铵和甲醇梯度洗脱，二极管阵列检测器可变波长下检测，外标法峰面积