基因工程制药PPT课件.ppt

二 质粒不稳定的原因 含质粒菌产生不含质粒菌的频率两种菌的比生长率的大小对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利 1 三 提高质粒稳定性的方法 1 选择合适的宿主菌2 选择合适的载体3 选择性压力4 分阶段控制培养5 控制培养条件6 固定化 2 第五节基因工程菌生长代谢的特点 大肠杆菌的蛋白 菌体量的比值是基本恒定的 因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性 减少代谢副产物积累 提高外源蛋白产率有重要意义 3 第五节基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长与能量的关系能量不足时 菌体代谢产生乙酸抑制菌体生长 调控操作参数以控制菌体的生长 适当提高pH值 培养方式 培养基 代谢工程的方法菌体生长与前体供应的关系竞争 4 第六节基因工程菌中试 1 工程菌选择2 反应器设计3 发酵培养基组成4 工艺最佳化育参数监测控制5 计算机的应用 5 第七节基因工程菌的培养 一 培养方式补料分批培养连续培养透析培养固定化培养 6 二 基因工程菌发酵工艺 1 培养基碳源 葡萄糖 乳糖氮源 酪蛋白水解物 色氨酸无机磷 大分子的合成 糖代谢2 接种量过小 延长菌体延迟期过大 代谢积累物过多 7 基因工程菌发酵工艺 3 温度复制 转录 翻译或小分子调节分子的合成等水平4 溶解氧5 诱导时机6 pH值 8 三 高密度发酵 高密度发酵的概念一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCM L以上 理论上的最高值可达200gDCM L 高密度发酵的优点提高 减少 降低 缩短 9 1 影响高密度发酵的因素 培养基C N寻找葡萄糖的替代物溶氧浓度通气量和搅拌速度措施 提高氧分压 克隆血红蛋白基因 与小球藻混合培养pH值氨水的使用 10 1 影响高密度发酵的因素 温度不同的培养阶段采用不同的温度代谢副产物二氧化碳 乙酸 11 2 实现高密度发酵的措施 发酵条件的改进培养基的选择建立流加式培养方式提高供氧能力构建产乙酸能力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 12 第七节生物技术药物的分离纯化 一 建立分离纯化工艺的根据二 分离纯化的基本过程三 生物分离过程经验法则 13 一 建立分离纯化工艺的根据 1 含目的产物的起始物料的特点2 物料中杂质的种类和性质3 目的产物特性产物的化学 物理和生物学特性4 产品质量的要求产品纯度 生物活性 比活 14 二 分离纯化的基本过程 细胞破碎固液分离浓缩与初步纯化高度纯化制剂产品 15 三 生物分离过程经验法则 16 在分离过程中尽早减小样品体积 生物分离过程中两个需要尽可能减小的变量是成本和时间首先 设计者要确定能够满足分离要求必需的分离步骤此后 分离过程的成本就与样品的体积或流速紧密相关减小样品体积的实质是除去水分沉淀 萃取 吸附 亲和 17 举例 生物反应器 混合器 离心机 混合器 离心机 一级丁醇萃取液 丁醇 二级丁醇萃取液 丁醇 链霉素的萃取流程 18 将耗费最高的分离步骤 通常是高分辨率的步骤 放在最后 原因有二1 分离操作的设备投资和操作费用是与样品流速相关的 虽然高分离成本主要是由高分辨率高所致 但也不难理解此时处理的样品流率也应尽可能低2 可以在得到合格的产品后立即成形和包装 19 遵守KISS原则 保持过程简单和笨拙 keepitsimpleandstupid 只有当从易于过程控制和故障排除方面考虑时 才会希望用所谓先进的 精致的流程在能够满足目标的前提下 该过程所包含的步骤应该尽可能少 20 举例 固定化细胞反应器 加热 调pH至2 7 冷却至25 离心机 干燥器 天冬氨酸沉淀 天冬氨酸生产 21 2019 12 28 22 尽早提炼组分 原因减少分离步骤杂质存在导致酶降解或产品变性 23 举例 生物反应器 离心机 阳离子交换剂 反渗透膜 固体 反应器料液的废液 氨和水 采用阳离子交换剂初步分离赖氨酸 24 其他 依据类似商业产品的生产过程来设计生物分离过程生物分离过程和生物反应器研发同步进行时的问题利用模拟料液进行中试实验在分离过程设计中 当生物反应器料液不足或产品浓度低于预期值时 一个实用的解决方法是向生物反应器流体中加入目标组分 使其达到预期值 25 第三节包含体的分离与蛋白质的复性 一 包含体外源蛋白质在E coli中高效表达时常形成不可溶 无生物活性的聚集体 二 包含体的形成部分的折叠的中间态之间相互作用的成果 26 三 包含体的分离与蛋白质复性 一 分离细胞破碎 低速离心或洗滤 包含体沉淀 二 蛋白质的复性步骤1 用含有蔗糖 Triton 100 脱氧胆酸或尿素缓冲液冲洗包含体 2 用变性尿素或盐酸胍以及SDS等变性剂溶解包含体使其变成伸展的肽链 还原剂还原二硫键 3 脱除变性剂 加入氧化剂使伸展的肽链折叠成正确的空间结构 27 包含体复性的方法 1 稀释 透析2 含二硫键的蛋白复性 1 空气氧化法 2 加入氧化 还原转换试剂 3 用还原试剂或亚硫酸钠 连四硫酸钠使变性蛋白磺化以保护巯基 4 加入二硫苏糖醇3 封闭蛋白的疏水簇4 凝胶过滤层析复性5 小分子添加剂6 加入分子伴侣7 人工分子伴侣 28 第八节 质量控制 一 原材料的质量控制原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性 重组微生物来自单一克隆 所用质粒纯而稳定 以保证产品质量的安全性和一致性 29 根据质量控制要求应了解以下特性 1 明确目的基因的来源 克隆经过 并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证2 应提供表达载体的名称 结构 遗传特性及各组成部分 如复制子 启动子 的来源与功能 构建中所用位点的酶切图谱 抗生素抗性标记物 30 3 应提供宿主细胞的名称 来源 传代历史 检定结果及其生物学特性 4 须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性 提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列 详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等 31 二 培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中 要求种子克隆纯而稳定 在培养过程中 要求工程菌所含的质粒稳定 始终无突变 在重复生产发酵中 工程菌表达稳定 始终能排除外源微生物污染 32 生产基因工程产品应有种子批系统 并证明种子批不含有致癌因子 无细菌 病毒 真菌和支原体等污染 并由原始种子批建立生产用工作细胞库 原始种子批须确证克隆基因DNA序列 详细叙述种子批来源 方式 保存及预计使用期 保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性 33 对生产种子 应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料 并控制微生物污染 提供培养生产浓度与产量恒定性数据 依据宿主细胞 载体系统稳定性 确定最高允许传种代数 在培养过程中 应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征 依宿主细胞 载体稳定性与产品恒定性 规定持续培养时间 并定期评价细胞系统和产品 34 培养周期结束时 应监测宿主细胞 载体系统的特性 如质粒拷贝数 宿主细胞中表达载体存留程度 含插入基因载体的酶切图谱等 35 三 纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据 确证提纯物分子批间保持一致性 外源蛋白质 DNA与热源质控制在规定限度以下 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质 核酸 糖类 病毒 培养基成分及精制工序本身引入的化学物质 并有检测方法 36 四 目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求 产品的鉴别 纯度 活性 安全性 稳定性和一致性 它需要利用生物化学 免疫学 微生物学 细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法 37 产品的鉴别常用的鉴定方法 电泳方法 SDS PAGE 等电聚焦 免疫电泳免疫学方法 放射免疫 RIA 酶联免疫 ELISA 受体结合试验高效液相色谱 HPLC 肽图分析法 末端序列分析 圆二色谱 核磁共振 38 肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质 对生成的肽段进行分离分析 它是检测蛋白质一级结构最有效的方法 该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法 常用HPLC 毛细管电泳 39 氨基酸成分分析50个氨基酸较理想 部分氨基酸序列分析N端15个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标 重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定 蛋白质二硫键分析测定方法有 对氯汞苯甲酸法等5 5 二硫基双 2 硝基苯甲酸法 40 纯度分析 蛋白质含量测定SDS PAGE 等电聚焦 各种HPLC 毛细管电泳 杂质 蛋白类杂质残留宿主细胞蛋白采用免疫分析的方法 非蛋白类杂质病毒 细菌等微生物 热原 内毒素 致敏源及DNA 41 常用检测方法 内毒素 鲎试剂 家兔