基因工程操作流程PPT课件.ppt

为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢 启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合 就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样 将100个以上启动子的顺序进行了比较 发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序 称为 10和 35序列 这两个序列的共同顺序如下 35区 AATGTGTGGAAT 10区 TTGACATATATT 大多数启动子均有共同顺序 consensussequence 只有少数几个核苷酸的差别 1 终止子 2 能转录相应的信使RNA 能编码蛋白质 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 有调控作用 含启动子 终止子等 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 3 二 真核细胞的基因结构 补 编码区 与RNA聚合酶结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子 外显子 4 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 连续 不连续 编码区 非编码 5 1 2基因工程的基本操作程序 从细胞中分离出DNA 限制酶截取DNA片断 分离大肠杆菌中的质粒 DNA重组 用重组质粒转化大肠杆菌 培养大肠杆菌克隆大量基因 6 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 7 目的基因 主要指编码蛋白质的结构基因 也可以是一些具有调控作用的因子 取出DNA 用限制酶切断DNA 1 目的基因的获取 8 获取目的基因的方法一 从基因文库中获取目的基因 基因文库 genelibrary 的概念 将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 9 组织或细胞染色体DNA 限制性核酸内切酶 DNA片段 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 载体 受体菌 基因组文库 存在于转化细菌内 由载体所携带的所有基因组DNA的集合 10 mRNA 逆转录酶 cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 载体 含重组分子的转化菌 受体菌 用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后 建立的基因文库 cDNA文库 11 12 PCR polymerasechainreaction 多聚酶链式反应 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 通过此技术 可获取大量的目的基因 获取目的基因方法二 利用PCR技术扩增目的基因 PCR扩增仪 13 原理 DNA双链复制 反应过程 1 变性 将反应系统加热至90 95 使模板DNA完全变性成为单链 2 退火 将温度下降至55 60 左右 使引物与模板DNA退火结合 3 延伸 将温度升至70 75 DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应 上述三个步骤为一个循环 经25 30次循环后 可将模板DNA扩增达百万倍 反应体系 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTP及缓冲液 15 利用PCR技术扩增目的基因 16 DNA合成仪 过程 适用范围 已知核苷酸序列 基因的核苷酸数量较少 获取目的基因方法三 化学合成法 17 小结 目的基因的获取 三种方法 1 从基因文库中获取 适用于目的基因序列为未知的情况 2 利用PCR技术扩增 适用于目的基因的序列为已知的情况 3 人工合成 适用于目的基因不是很大且其序列是已知的 18 基因表达载体的组成 目的基因启动子终止子标记基因等 2 基因表达载体的构建 19 常用的受体细胞 动物 植物 微生物 转化 目的基因进入受体细胞内 并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 3 目的基因导入受体细胞 20 1 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法 转化方法 2 将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 3 将目的基因导入微生物细胞 常用CaCl2 21 1 将目的基因导入植物细胞 常用方法 农杆菌转化法适用范围 双子叶植物和裸子植物 转化过程 22 基因枪法又称微弹轰击法 是籍高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术 这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法 但是成本较高 此技术最早由我国学者周光宇提出的 植物花粉在柱头上萌发后 花粉管要穿过花柱直通胚囊 花粉管通道法就是在植物受粉后 花粉形成的花粉管还未愈合前 剪去柱头 然后 滴加DNA 含目的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 23 2 将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 24 3 将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞的转化方法 用Ca 常用CaCl2 处理细菌细胞 以增大细胞壁的通透性 使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 感受态细胞 将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合 在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 完成转化 25 1 分子水平的检测 检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 4 目的基因的检测和鉴定 2