志贺氏菌PPT课件.ppt

二 志贺氏菌的检验 1 志贺氏菌的检验 志贺氏菌属于肠杆菌科志贺氏菌属 根据生化特性不同将其分为四个群 A群 痢疾志贺氏菌 B群 福氏志贺氏菌C群 鲍氏志贺氏菌 D群 宋内氏志贺氏菌志贺氏菌属的细菌统称痢疾杆菌 临床上能引起痢疾症状的病原微生物很多 如志贺氏菌属 沙门氏菌属 变形杆菌属 埃希氏菌属等 还有阿米巴原虫及病毒等 其中以志贺氏菌属引起的细菌性痢疾最为常见 是细菌性痢疾的主要病原菌 通过食品和饮水传播 引起人的疾病 人对志贺氏菌的易感性很高 人是它的唯一宿主 所以在食物和饮用水的卫生检验时 常以是否含有志贺氏菌作为指标 2 志贺氏菌的检验 一 实验目的了解志贺氏菌生物学特性及原理掌握志贺氏菌检验方法 3 检验志贺氏菌的方法很多 但食品卫生微生物检验具有法规性 检验必须采用国家标准规定的方法 近年来发展了许多快速检验的新方法 如技术等 我们下面介绍的方法即是国家标准规定的方法 要弄清检验原理 首先需要了解志贺氏菌的生物学特性 4 志贺氏菌的检验 二 志贺氏菌的生物学特性1 形态与染色 革兰氏阴性无芽胞杆菌 无荚膜 无鞭毛 不运动 有菌毛 革兰氏阴性鲍氏志贺菌 5 志贺氏菌的菌毛 6 志贺氏菌扫描电镜照片 7 志贺氏菌扫描电镜照片 8 志贺氏菌的透射电镜照片 9 二 志贺氏菌的生物学特性 2 志贺氏菌的培养特性 需氧或兼性厌氧 营养要求不高 能在普通培养基上生长 最适温度为37 最适pH为6 4 7 8 37 培养18 24小时后菌落呈圆形 微凸 光滑湿润 无色 半透明 边缘整齐 直径约2mm 宋内氏菌菌落一般较大 较不透明 并常出现扁平的粗糙型菌落 在液体培养基中呈均匀浑浊生长 一般不形成沉淀 无菌膜形成 10 菌落形态学 关注菌落的形态 大小 边缘 突起 颜色 质地等等 都是区分细菌的重要手段 11 福氏志贺氏菌的菌落特征 12 宋内志贺菌乳糖迟发酵菌株在麦康凯平板上的菌落特征 13 14 15 16 17 18 19 细菌在肉汤培养基中的生长 均匀浑浊生长是什么意思 20 二 志贺氏菌的生物学特性 3 志贺氏菌的生化特性 本菌属都能分解葡萄糖 产酸不产气 大多不发酵乳糖 仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖 靛基质产生不定 甲基红阳性 VP试验阴性 不分解尿素 不产生H2S 与肠杆菌科各属细菌相比较 志贺氏菌的主要鉴别特征为不运动 对各种糖的利用能力较差 并且在含糖的培养基内一般不形成可见气体 根据生化反应可进行初步分类 21 不发酵乳糖和发酵乳糖菌落 22 二 志贺氏菌的生物学特性 4 志贺氏菌的抗原构造与分型 志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原 O 及表面抗原 K 组成 主要抗原有三种 型特异性抗原 群特异性抗原 表面抗原 K抗原 根据抗原构造的不同 按最新国际分类法 将本属细菌分为四个群 39个血清型 包括亚型 附 志贺氏菌抗原分类 23 附 志贺氏菌抗原分类 抗原构造与分型 志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原 O 及表面抗原 K 组成 主要抗原有三种 型特异性抗原 型多糖抗原为菌体抗原的一种 是光滑型菌株所含有的重要抗原 当菌株变为粗糙型时 此抗原也常随之消失 各菌型所含的型抗原不同 可用于区别菌种的型别 群特异性抗原 为光滑型菌株的次要抗原 也是菌体抗原的一种 特异性较低 常在数种近似的菌内出现 在福氏菌株中 由于所含群抗原不同 可将某些菌型分为多种亚型 如福氏菌2型 根据群抗原不同 可分成2a 2b两个亚型 表面抗原 K抗原 在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原 不耐热 加热100 1小时即被破坏 具有此种抗原的菌株 可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集 24 志贺氏菌属的四个群 根据抗原构造的不同 按最新国际分类法 将本属细菌分为四个群 39个血清型 包括亚型 A群 也称志贺氏菌群 有10个血清型 不发酵甘露醇 无鸟氨酸脱羧酶 与其他各群细菌无血清学联系 B群 也称福氏菌群 已有13个血清型 包括亚型和变种 最近又发现3个亚型 1c 4c 5b 发酵甘露醇 无鸟氨酸脱羧酶 抗原结构较复杂 各型间有交叉凝集 每一福氏菌型具有二种抗原 即型特异性抗原和群抗原 前者只存在于同型菌株中 后者有许多种 存在于福氏各菌型中 例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外 尚含有4 6群抗原 25 C群 也称鲍氏菌群 有15个血清型 分解甘露醇 无鸟氨酸脱羧酶 各型内无交叉凝集 D群 也称宋内氏菌群 仅有一个血清型 分解甘露醇 有鸟氨酸脱羧酶 迟缓发酵乳糖 有 S相光滑菌落 相 R粗糙菌落 之分 26 福氏志贺菌在HE琼脂平板上的菌落特征蓝绿色大肠埃希菌红色较大 27 二 志贺氏菌的生物学特性 5 志贺氏菌的抵抗力 志贺氏菌属与沙门氏菌属及其他肠道杆菌相比 对理化因素抵抗力较低 对酸较敏感 必须使用含有缓冲剂的培养基 在外界环境中的生存力 以宋内氏最强 福氏菌次之 痢疾志贺氏菌最弱 一般在潮湿土壤中能存活34天 37 水中存活20天 在粪便内 室温 存活11天 日光直接照射30分钟 56 60 10分即被杀死 对高温和化学消毒剂很敏感 1 石炭酸中15 30分钟即被杀死 对氯霉素 磺胺类 链霉素敏感 但易产生耐药性 28 二 志贺氏菌的生物学特性 6 志贺氏菌的变异性 S R型变异 菌落可由光滑型变为粗糙型 同时常伴有生化反应 抗原构造和致病性的变异 在机体内 尤其在慢性患者和恢复期患者 志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性 成为不典型菌株 但其中部分不典型菌株 可通过10 胆汁肉汤等返祖为典型菌株 故在慢性患者或带菌者粪便检查时 对这类菌株要特别注意 必须多次反复检查 因这对传染源的发现及控制有重要意义 29 二 志贺氏菌的生物学特性 耐药性变异 自从广泛使用抗菌素以来 志贺氏菌的耐药菌株不断增加 给防治工作带来许多困难 国内部分地区报道 1972 1974 志贺氏菌对四环素的耐药率达74 氯霉素73 6 97 链霉素84 98 金霉素75 100 磺胺类97 100 可见国内对常用几种抗菌素的耐药率相当高 30 二 志贺氏菌的生物学特性 毒力变异与其他变异 1963年南斯拉夫Mel氏首先创用依赖链霉素的志贺氏菌株 依链Sd株 口服预防痢疾 Sd株是一株必须有链霉素存在下才能生长的菌株 其毒力减弱但仍保持免疫原性 美国以天然变异无毒株与大肠杆菌杂交而获得的MH株制成疫苗 其免疫效果和稳定性均较Sd株差 我国正大力利用变异方法通过动物和药物处理等寻找安全有效可供口服的痢疾杆菌活菌苗 并已取得初步成效 31 二 志贺氏菌的生物学特性 7 志贺氏菌的致病性志贺氏菌引起的细菌性痢疾 主要通过消化道途径传播 根据宿主的健康状况和年龄 只需少量病菌 至少为10个细胞 进入 就有可能致病 致病因素 志贺氏菌的致病作用 主要是侵袭力 菌体内毒素 个别菌株能产生外毒素 32 二 志贺氏菌的生物学特性 侵袭力 志贺氏菌进入大肠后 由于菌毛的作用粘附于大肠粘膜的上皮细胞上 继而进入上皮细胞并在内繁殖 扩散至邻近细胞及上皮下层 由于毒素的作用 上皮细胞死亡 粘膜下发炎 并有毛细血管血栓形成以至坏死 脱落 形成溃疡 志贺氏菌一般不侵犯其他组织 偶尔可引起败血症 目前认为不论是产生外毒素的还是只有内毒素的志贺氏菌 必须侵入肠壁才能致病 因此 对粘膜组织的侵袭力是决定致病力的主要因素 33 二 志贺氏菌的生物学特性 内毒素 志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素 作用于肠壁 使通透性增高 从而促进毒素的吸收 继而作用于中枢神经系统及心血管系统 引起临床上一系列毒血症症状 如发热 神志障碍 甚至中毒性休克 毒素破坏粘膜 形成炎症 溃疡 呈现典型的痢疾脓血便 毒素作用于肠壁植物神经 使肠道功能紊乱 肠蠕动共济失调和痉挛 尤其直肠括约肌最明显 因而发生腹痛 里急后重等症状 34 2019 12 28 35 二 志贺氏菌的生物学特性 外毒素 痢疾志贺氏菌1型及部分2型 斯密兹痢疾杆菌 菌株能产生强烈的外毒素 为蛋白质 不耐热 75 80 1小时即可破坏 其作用是使肠粘膜通透性增加 并导致血管内皮细胞损害 外毒素经甲醛或紫外线处理可脱毒成类毒素 能刺激机体产生相应的抗毒素 一般认为具有外毒素的志贺氏菌引起的痢疾比较严重 36 二 志贺氏菌的生物学特性 志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类 A 急性细菌性痢疾 又分急性典型 急性非典型 急性中毒性菌痢三型 B 慢性细菌性痢疾 又分慢性迁延型 慢性隐伏型 慢性急性发作型三型 37 附 志贺氏菌引起的细菌性痢疾分类 志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类6型 A 急性细菌性痢疾 又分急性典型 急性非典型 急性中毒性菌痢三型 急性典型菌痢症状典型 有腹痛腹泻 脓血粘便 里急后重 发热等症状 各型菌都可引起 以志贺氏菌引起的较重 宋内氏菌引起的较轻 经治疗 预后良好 如治疗不彻底 可转为慢性 急性非典型菌痢症状不典型 易诊断错误延误治疗 常导致带菌或慢性发展 急性中毒性菌痢小儿多见 各型菌都可发生 中毒性菌痢一系列的病理生理变化 主要是内毒素造成机体微循环障碍的结果 导致内脏淤血 周围循环衰竭 休克 主要功能器官灌注不足 发生心力衰竭 脑水肿 急性肾功能衰竭 严重微循环障碍 再加上内毒素损伤血管内皮细胞 激活凝血因子等 而发生弥漫性血管内凝血 DIC 38 附 志贺氏菌引起的细菌性痢疾分类 B 慢性细菌性痢疾 又分慢性迁延型 慢性隐伏型 慢性急性发作型三型 慢性迁延型 通常由急性菌痢治疗不彻底等引起 病程超过2个月 时愈时发 大便培养阳性率低 在有临床症状时为急性发作型 该型往往在半年内有急性菌痢病史 慢性隐伏型菌痢 是在一年内有过菌痢病史 临床症状早已消失 但直肠镜可发现病变或大便培养阳性 39 附 志贺氏菌引起的细菌性痢疾分类 慢性急性发作型 有急性菌痢史 常因饮食不当 受凉 劳累等而激起急性发作 但症状较急性期轻 免疫性 病后有一定的免疫力 但免疫期短 也不稳定 40 三 志贺氏菌的检验 1 增菌称取检样25g 加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内 固体食品用均质器以8000 10000r min打碎1min 或用乳钵加灭菌砂磨碎 粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化 于36 培养6 8h 培养时间视细菌生长情况而定 当培养液出现轻微混浊时即应中止培养 41 三 志贺氏菌的检验 2 分离和初步生化试验取增菌液1环 划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个 另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个 于36 培养18 24h 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落 42 HE琼脂平板原理及照片 发酵乳糖的某种肠杆菌 酸碱指示剂为溴麝香草酚蓝 发酵乳糖产酸使溴麝香草酚蓝变为黄色 43 HE琼脂平板原理及照片 不发酵乳糖的某种肠道菌 而且产生硫化氢 可能是沙门氏菌 不分解乳糖的菌株分解牛肉膏蛋白胨产碱 使溴麝香草酚蓝变为蓝绿色或蓝色 菌落也变为蓝绿色或蓝色 44 志贺氏菌在HE琼脂平板 45 SS平板原理及照片 大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌 酸硷指示剂为中性红 配方中还有煌绿 46 SS平板原理及照片 是沙门氏菌 有黑色中心 如果没有黑色中心 可能是志贺氏菌 47 麦康凯琼脂平板照片 乳糖阴性 乳糖阳性 培养基中加有乳糖结晶紫水溶液中性红水溶液 48 EMB平板照片及原理 原理 伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料 在此亦作为指示剂 大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时 故可染上酸性染料伊红 又因伊红与美兰结合 该两种染料即结合成复合物 使大肠菌群产生带核心的 有金属光泽的深紫色的 龙胆紫的紫色 阳性菌落 从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光 在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色 圆形 边缘整齐 表面光滑湿润 常有金属光泽 由于药物影响 亦呈现紫色 粉紫 中心灰紫 无黑心 湿润等 常为大肠杆菌 均应注意挑选 49 伊红美蓝琼脂平板照片 50 志贺氏菌在伊红美兰平板上 51 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上 52 2 分离和初步生化试验挑取平板上的可疑菌落 接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管 一般应多挑几个菌落 以防遗漏 经36 培养18 24h 分别观察结果 53 葡萄糖半固体原理及结果 54 附 三糖铁琼脂现象及原理分析 三糖铁 TSI 琼脂试验的原理试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物 穿刺接种并涂布于斜面 置36 1 培养18 24h 观察结果 55 附 三糖铁琼脂现象及原理分析 三糖铁琼脂 TSI 成分 蛋白胨20 0g 牛肉膏3 0g 乳糖10 0g 蔗糖10 0g 葡萄糖1 0g 硫酸亚铁铵 含6个结晶水 0 5g 酚红0 025g或5g L溶液5mL 氯化钠5 0g 硫代硫酸钠0 5g 琼脂12 0g 蒸馏水1000 0mL除酚红和琼脂外 将其他成分加入400mL蒸馏水中 搅拌均匀 静置约10min 加热煮沸至完全溶解 调至pH7 4 0 1 另将琼脂加入600mL蒸馏水中 搅拌均匀 静置约10min 加热煮沸至完全溶解 将上述两溶液混合均匀后 再加入酚红指示剂 混匀 分装试管 12mm 100mm 每管约2 4mL 高压灭菌121 10min或115 15min 灭菌后置成高层斜面 呈桔红色 56 三糖铁琼脂原理分析 本培养基适合于肠杆菌科的鉴定 用于观察细菌对糖的利用和硫化氢 变黑 的产生 该培养基含有乳糖 蔗糖和葡萄糖的比例为10 10 1 只能利用葡萄糖的细菌 葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄 但因量少 生成的少量酸 因接触空气而氧化 加之细菌利用培养基中含氮物质 生成碱性产物 故使斜面后来又变红 底部由于是在厌氧状态下 酸类不被氧化 所以仍保持黄色 而发酵乳糖的细菌 e coli 则产生大量的酸 使整个培养基呈现黄色 如培养基接种后产生黑色沉淀 是因为某些细菌能分解含硫氨基酸 生成硫化氢 硫化氢和培养基中的铁盐反应 生成黑色的硫化亚铁沉淀 57 下面照片所示2 3 4 可能是大肠杆菌 沙门氏菌还是志贺氏菌 答案 2 志贺氏菌3 沙门氏菌4 大肠杆菌 58 3 下述培养物可以弃去 a 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物 无鞭毛无动力 b 在18 24h内发酵乳糖 蔗糖的培养物 不发酵乳糖 仅宋内志贺氏菌迟缓发酵乳糖 c 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物 分解葡萄糖 兼性厌氧 d 产气的培养物 分解葡萄糖产酸不产气 e 有动力的培养物 无动力 f 产生硫化氢的培养物 不产生硫化氢 凡是乳糖 蔗糖不发酵 葡萄糖产酸不产气 福氏志贺氏菌6型可产生少量气体 无动力的菌株 可做血清学分型和进一步的生化试验 59 三 血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物 做玻片凝集试验 先用4种志贺氏菌多价血清检查 如果由于K抗原的存在而不出现凝集 应将菌液煮沸后再检查 如果呈现凝集 则用A1 A2 B群多价和D群血清分别试验 如系B群福氏志贺氏菌 则用群和型因子血清分别检查 福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1 可先用群因子血清检查 再根据群因子血清出现凝集的结果 依次选用型因子血清检查 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株 可用鲍氏多价1 2 3分别检查 并进一步用1 15各型因子血清检查 如果鲍氏多价血清不凝集 可用痢疾志贺氏菌3 12型多价血清及各型因子血清检查 60 61 血清 诊断血清 是应