基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析小分子化合物.doc

MALDI-TOF MS分析小分子化合物新方法 对于分子量小于400Da的化合物, 使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS) 的常规方法难以检测，这主要是由于小分子基质带来的干扰。为此，本方法发展了一种MALDI-TOF MS分析小分子的新策略，将小分子转移到高质量区域测定，成功的分析了赤霉酸等一系列小分子化合物。1 实验部分Bruker公司AUTOFLEX III MALDI-TOF 质谱仪，氮分子激光，波长355nm，使用前用混合多肽（购自Bruker公司, 包括：血管紧张肽I, 血管紧张肽II, P物质, 蛙皮素, 促肾上腺皮质激素1-17, 促肾上腺皮质激素18-39, 生长激素释放抑制激素 28）外标法校正仪器。金属酞箐化合物的合成参照已发表的文献，最终产物经过紫外可见吸收光谱（UV-Vis），质谱（MALDI-TOF MS）以及核磁（NMR）表征。样品和基质分别溶于适当溶剂，二者按照一定比例混合均匀，取1l混合溶液滴在MALDI 样品靶上，或者直接吸取1l样品溶液滴在靶上，待溶剂自然挥发样品结晶后，送入质谱仪，进行质谱分析。实验中数据采集时所用参数如下：加速电压19kV，反射模式，激光频率10Hz，使用最大激光能量的40-90%，累加30-200次。使用Bruker公司的XMASS软件，flexControl和flexAnaysis软件进行数据采集和数据处理。2 结果与讨论2. 1金属酞箐基质的发现酞箐化合物是一类具有电子共轭结构的大环化合物，具有良好的热稳定性和化学稳定性一直被广泛用作染料，此外，由于其独特的光、电、磁及对某些气体的敏感性等方面的特性而被应用于化学传感器、非线性光学材料、光盘信息记录材料、太阳能电池材料、燃料电池中的电催化材料、场效应晶体管、气体检测及光动力学治疗癌症等许多方面。在用MALDI-TOF MS分析金属酞箐类化合物时，由于该类化合物在紫外可见区有吸收，可以吸收激光（波长337nm）能量，所以，在没有基质的情况下能够解吸电离得到分子离子峰。当使用常规基质，如-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）和2, 5-二羟基苯甲酸（DHB）时，三价金属酞箐化合物对基质分子有加合作用，而二价和四价金属酞箐化合物与基质分子没有加合作用。因此，利用三价金属酞箐化合物用于分析小分子，它可以将小分子从低质量区域转移到不受干扰的高质量区域，从而消除传统基质带来的干扰。2. 2 无基质时MALDI-TOF MS分析金属酞箐化合物编号MR缩写准确质量摩尔分子量1Al3+(aPc)Al(aPc)+827.3608827.92692Ga3+Ga(aPc)+869.3048870.66833In3+In(aPc)+915.2831915.76334Al3+(pPc)Al(pPc)+1131.48601132.31075Ga3+Ga(pPc)+1173.43001175.05226In3+In(pPc)+1219.40831220.14727Mg2+(hPc)Mg(hPc)968.2193969.20708Zn2+Zn(hPc)1008.16341010.31209SnONon(Pc)SnO(Pc)648.0469647.232410SnF2SnF2(Pc)670.0488669.229911TiOTiO(Pc)576.0926576.3894图1 金属酞箐化合物（MPcs）的结构(B)(A)(D)(C)图2 紫外-可见吸收光谱 (A) 金属酞箐化合物2 (B) 金属酞箐化合物7(C) 基质CHCA (D) 基质DHB金属酞箐化合物（结构见图1所示）有Q带和B带两个吸收带，这是-*跃迁引起的。MALDI-TOF MS所用激光波长为337nm，此波长刚好位于金属酞箐化合物B带吸收带内，图2 A是酞箐化合物2在200-500nm波段的紫外可见吸收光谱，它在324nm处有较高的吸收；图2 B是酞箐化合物7在此波段的吸收光谱，它在340nm处有较高的吸收。MALDI-TOF MS所用的基质CHCA和DHB能够吸收激光能量，其紫外可见吸收光谱见图2 C和D。金属酞箐化合物的吸收峰和两个基质的吸收有很大相似之处，不同的是前者的吸收峰比较宽而后者较窄，吸收峰值不完全相同，CHCA和DHB的吸收峰值分别是340nm和339nm，更接近激光波长。金属酞箐化合物能吸收激光能量，理论上在不加基质的情况下它能直接解吸电离产生分子离子峰。图3为不加基质情况下酞箐化合物2的质谱图及实验所得同位素分布与理论同位素分布的对比。从对比中看到，二者十分吻合。(A)(B)图3 无基质情况下酞箐化合物2的质谱图(A)及理论与实际同位素分布的对比(B)2. 3 使用常规基质时MALDI-TOF MS分析金属酞箐化合物表2 使用CHCA和DHB为基质分析金属酞箐化合物的MALDI结果基质编号Masscal.Massdet.CHCA1234567891011827.4869.3915.31131.51173.41219.4968.21008.2648.0670.0576.11016.51058.41104.41320.61362.51408.5968.21008.2648.0670.0576.1DHB1234567891011827.4869.3915.31131.51173.41219.4968.21008.2648.0670.0576.1981.51023.41069.41285.61327.51373.5968.21008.2648.0670.0576.1(B)(A)图4 以CHCA为基质时（A）金属酞箐化合物2的质谱图以及（B）实际与理论同位素分布的对比使用CHCA和DHB作为基质，用MALDI-TOF MS对一系列金属酞箐化合物进行分析，所得质谱结果见表2。其中，三价金属酞箐化合物1-6，检测得到的分子量比理论计算值大。以化合物2为例，当以CHCA为基质时（其质谱图见图4 A），检测得到的质荷比（m/z）为1058.4，而理论值为869.3。用检测值减去理论计算值得到的值是189.1，相当于CHCA的分子量。经过计算发现，其余五个化合物也是这种情况。因此认为，化合物1-6在检测的过程中与CHCA的分子发生了加合作用，且二者比例是1:1。 用XMASS对化合物2与CHCA加合物 M+CHCA+ 的同位素进行模拟，与实验得到的同位素分布相比较（见图4 B），二者吻合得很好。实际上化合物1-6是酞箐阳离子，带一个正电荷M+，当它与中性的CHCA分子结合后形成M+CHCA+ 带一个正电荷。而当以DHB为基质时，化合物1-6与DHB的分子发生了加合作用，二者的比例是1:1。从表2中，还可以看到，对于金属酞箐化合物7-11，包括二价金属酞箐和四价金属酞箐，检测得到的分子量与理论计算值相符。基于以上的结果，可以大胆地设想：三价金属酞箐作为MALDI MS新基质分析小分子化合物，利用它与小分子的加合作用将小分子从低质量区域转移到高质量区域，就能解决MALDI-TOF MS无法分析赤霉素等小分子样品（ Ga3+ In3+，这和它们形成络合物的能力相一致。因为Al、Ga、In的价电子结构分别为3s23p1、 3d104s24p1、4d105s25p1，轨道杂化以后可以形成3、4、6配位化合物。事实上，它们可能与酞箐环的四个配位氮原子形成了四面体配位结构，当与有配位能力的小分子样品相遇时，可能会全部或部分转变成八面体配位结构（图7 所示），从而出现了观测到的质谱峰。图7 A表示的是金属酞箐和样品分子之间可能发生的反应。图7 B表示的是八面体配位 MPcAHA 结构和最可能的离子化路线。图 7 (A) 金属酞箐和样品分子之间可能发生的反应；(B) 八面体配位MPcAHA最可能的离子化路线图 8 混合物样品的MALDI谱图使用铝酞箐作基质(A)正离子模式下 (B)负离子模式下，各个峰对应：(a) 水杨酸 (pKa=2.97) (b) 4-叔丁基苯酚 (pKa=10.39) (c) 咔啉 (pKa=14.9) (d) 棕榈酸 (pKa=9.7) (e) 硬脂酸 (pKa=10.15) (f) 吲哚 (pKa=16.2, 未检测到)除了基质本身，样品的pKa值也会影响质谱信号。检测了六种不同pKa的等摩尔的混合物