融合蛋白tTf-EG3287对肿瘤的靶向栓塞治疗ppt课件.ppt

融合蛋白tTf EG3287对肿瘤的靶向栓塞治疗 姓名 谢鑫专业 肿瘤学年级 2015级学校 福建医科大学导师 陈玉强教授 主要内容 研究背景主要研究内容创新点研究目的和意义技术路线进度安排实验结果及分析实验总结 背景介绍 人体肿瘤大部分为实体瘤 实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成 后者主要包括血管 淋巴管 结缔组织 炎细胞及细胞外基质等成分 其中血管和结缔组织起营养 支持瘤细胞的作用 肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成 angiogenesis 和淋巴管生成 1ymphangiogenesis 实现的 并在肿瘤的生长和扩散 侵袭和转移 中起重要作用 研究背景 已有研究证明 肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级 放射治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值 研究背景 1971年Folkman提出了抗肿瘤血管治疗的策略 使得该治疗在实验研究和临床上取得了显著成果 研究发现在这里血管在肿瘤发生 发展 生长和转移过程中发挥着关键的作用 与传统的化疗或放疗相比 该方法对肿瘤的选择性更高 毒副作用更小 将这三种方法联合使用可有效延长患者生存期 一 肿瘤血管再生的条件及机制 1 血管生成开关 缺少新生血管的肿瘤往往被限制在很小的范围内 显微镜下才能看到小至几百微米的原位癌及转移瘤 大至皮肤或膀胱的原位癌 体积也仅为1 2mm 当肿瘤体积 2mm 时 如果没有新生血管生成 肿瘤组织将保持静息状态或退化 反之 肿瘤体积呈指数倍增长 2 肿瘤血管特性 生长活跃的恶性肿瘤常富于血管如内分泌肿瘤 肾癌 骨肉瘤 绒毛膜癌 破骨细胞瘤 胶质母细胞瘤和肝细胞癌等 不同肿瘤血管的形态又有一定的差异 如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富 而且内皮细胞呈不同程度的增生 肥大 绒毛膜癌 肝细胞癌等血管呈壁薄 明显扩张的血窦 动态的 不停增殖 形状不规则 缺少小动脉 毛细血管和小静脉的正常分级排列 内皮细胞基因表达异常 缺乏基底膜 血流动力学异常 空间分布不均等 研究背景 3 肿瘤血管形成过程 肿瘤分泌释放VEGF 促血管生成因子及其受体 如Flt1 Flk1 Tie1 Tie2 活性上调 内皮细胞 周细胞活化 大小 形态发生变化 分离增殖加快 hemopoieticstemcells lymphaticendothelialcells Stimulationofangiogenesis vascularendoithelialcells Stimulationoflymphagiogenesis InhibitionofembryoicangiogenesisStimulationofpathologicalangiogenesis 研究背景 MMP等水解酶水平上调 基底膜 ECM降解 在粘附分子和整合素 如 v 3 avb5 的参与下 血管向肿瘤方向呈出芽式生长 出牙的内皮细胞形成官腔 管腔连接形成血管 SMC和Pericy等特异细胞参与形成新血管的外周结构 支持其稳定性抑制肿瘤生长的关键 抑制血管生成 标清 mp44 肿瘤血管调控机制 Positiveandnegativeregulationofangiogenesis 二 抗肿瘤血管的治疗策略 1 针对肿瘤血管生成的治疗策略 1 利用小分子药物和内源性血管生成抑制因子直接抑制血管内皮增殖 迁移 抑制ECM形成 诱导内皮细胞凋亡 2 利用中和抗体 可溶性受体 受体拮抗剂阻断血管生成因子传递 3 利用反义核酸或生物因子抑制血管生成因子表达 2 针对肿瘤血管阻断的治疗策略 20世纪80年代Denekamp提出VTAs vasculartargetingagents 治疗肿瘤的新概念 人们在小鼠体内观察到由于肿瘤血管的自然堵塞而导致实体瘤的退化 于是提出利用VTAs造成血管药理性阻塞治疗肿瘤的设想 这种提议后来被证实是有效的 例如一些抗体靶向性的毒素阻塞血管造成肿瘤的消退 另外某些抗微管药物也具有内在的VTAs活性 与传统的抗肿瘤化疗药物相比 血管阻断剂 vasculardisruptingagents VDAs VDAs拥有如下优势 抑瘤效应扩大 单一血管支配成百上千的肿瘤细胞 为其输送氧和营养物质并带走代谢产物 VDAs通过破坏单一血管即可杀灭大量肿瘤细胞 使抑瘤效应得以放大 循环中的药物直接作用于血管壁 内皮细胞 故药物易到达作用部位 这同时也要求此类化合物具有较好的水溶性 易于通过血管给药 如母体化合物水溶性不好 则可采用有效方法对其进行前体化改造 VDAs并不需要杀灭血管内皮细胞 只需改变其形态使局部血管发生闭塞即可达到抑制肿瘤的目的 而且 VDAs针对的是迅速增殖的肿瘤血管内皮细胞 正常组织的血管处于静息状态 不易受到损害 故副作用小 血管内皮细胞基因相对稳定 不易突变 因而不易产生耐药性 不同肿瘤的新生血管在生物学特性上是一致的 因此同一种VDA可以治疗不同的肿瘤 所有的肿瘤都要依赖于血管供给营养 肿瘤转移也依赖于血管 故其抗瘤谱广 能抗多药耐药性 MDR 并能抑制肿瘤扩散 作用时间短 研究表明超过99 的肿瘤细胞耐缺血时间不超过2h 因此只需极短的作用时间 VDAs即可起到抑制肿瘤的作用 疗效评估简单无创 通过MRI检查可以无创性地了解病变处的血流变化 可使VDAs的疗效评估变得简单 准确而易行 由于肿瘤深部的细胞完全依赖于血管供应养分 故肿瘤血管关闭后 肿瘤细胞是从内到外死亡 因此VDAs对肿瘤核心部位的破坏作用更强 这与传统的化疗及放疗 主要作用于供氧充足的肿瘤部位 正好互补 因此VDAs非常适合与放疗 化疗及热疗联合应用 以达到 双管齐下 的治疗效果 这种联合应用具有科学性和逻辑性 动物及临床试验均证实VDAs具有良好的放化疗增敏作用和与其他抗肿瘤药物 或疗法 的配伍特性 定向配基类 小分子类 VDAs 是利用抗体 多肽或者生长因子选择性与肿瘤内皮组织结合 并将其所携带的效应部分直接诱导 或通过导致血管内皮细胞死亡而间接导致血栓形成 进而引起宿主防御反应破坏肿瘤血管 或者造成内皮细胞形态改变而生理性地阻塞肿瘤血管 最终导致肿瘤细胞缺血缺氧而坏死 细胞因子诱导剂 微管蛋白结合剂 联合细胞毒性和血管靶向剂 黄酮类 黄酮醋酸 二甲基磺醌醋酸等 如ZD6126 CA4P AVE8062等 如TZT1027 OXi4503等 VDAs可分为两大类 以tTF为效应因子的肿瘤血管靶向治疗 肿瘤血管靶向治疗的靶点十分重要 其效应因子也同样重要 效应因子可以直接诱发血栓 杀伤内皮细胞而间接引发血栓 改变宿主抵御力而攻击瘤血管或者引发内皮细胞形态改变而阻塞肿瘤血管 目前所用的效应因子有毒素 细胞毒性药物 细胞因子 细胞凋亡诱导剂和放射性同位素等 这些研究主要侧重于抑制或破坏肿瘤组织血管 1997Huang等表达抗肿瘤血管标志物的抗体与组织因子胞外区截断组织因 truncatedTissueFactor tTF 的融合蛋白 将抗体的特异性传递和tTF潜在的凝血功能相结合 以tTF为效应因子靶向作用在肿瘤血管而选择性诱发肿瘤组织血管栓塞 在动物体内实验中有38 的肿瘤完全消退 由此建立了一种以tTF作为效应因子 阻断肿瘤血供 引发肿瘤坏死的肿瘤血管靶向治疗方法 组织因子 组织因子 TF 又称组织凝血活酶 TissueThromboplastin 或组织凝血活酶 TissueThromboplastinFactor 即凝血因子 Factor F 细胞表面抗原CD142 是唯一不存在于正常人血浆中的凝血因子 为外源性凝血系统的启动因子 也是体内活性最强的促凝物质之一 TF蛋白共含有263个氨基酸 分为三个区域 219个氨基酸组成的胞外区 1 219 23个氨基酸组成的跨膜区 220 242 和21个氨基酸组成的胞质区 243 263 TF胞外区的N区和C区由两个免疫球蛋白区组成 与其促凝功能关系最为密切 其中C区靠近细胞膜的赖氨酸Lys165和Lys166是TF F a复合物识别底物的关键部位TF的胞质区末端含3个有功能活性的丝氨酸残基 为蛋白激酶C PKC 的作用底物 其残基磷酸化具有细胞内信号传导功能 能促进VEGF的转录和合成 TF是外源性凝血级联反应的始发因子 凝血过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程 最终生成凝血酶 形成纤维蛋白凝块 组织损伤释放的TF 在钙离子的参与下能与凝血因子 F 一起形成1 1复合物 单独的F 或TF均无促凝活性 当F 与TF结合会很快被活化的凝血因子 F 激活为 a 从而形成TF F a复合物 后者比F a单独激活F 增强16000倍 截短的组织因子 截短的组织因子 tTF 是全长组织因子 TF 的胞外区 缺乏跨膜区而由一段独特的肽序列终止 以可溶性蛋白的形式存在于血液中 它保留与F 或F a结合并活化F 和F 的活性 但由于tTF空间构象的改变和跨膜区的缺失使其失去促凝活力 经证实 tTF对F 的活化能力是完整跨膜TF的10 5 研究表明 TF a复合物在带负电荷的磷脂膜表面能更有效地结合并活化F 因此 缺少膜内组分的tTF与F 结合尽管不需要磷脂膜表面 但不能有效活化F 不是一种有效的凝血剂 当tTF借助靶向载体结合于肿瘤血管细胞膜表面后 tTF活化F 的功能得到完全恢复 变成一种有效的凝血剂 研究证明 载体 tTF融合蛋白中的载体不仅特异性传递tTF 而且结合膜抗原后发挥了类似TF膜内组分的作用 同时 由于游离tTF对F 活化能力很低及体内的正常抗凝作用 治疗剂量不会诱发正常组织血管栓塞 tTF阻断肿瘤血管的研究进展 1997年Huang等通过制备抗肿瘤血管标志物MHCII的抗体与tTF的融合蛋白 融合蛋白通过抗MHCII抗体将具有潜在凝血的tTF传递到肿瘤血管 选择性诱发肿瘤组织血管栓塞 导致肿瘤衰退 建立了一种以tTF作为效应因子的肿瘤血管靶向治疗方法 这种以阻断肿瘤血管血流供应为目的的肿瘤分子靶向治疗已经引起相当关注 Ran等以抗血管内皮细胞粘附因子1 VCAM 1 抗体作为载体介导tTF 结果tTF选择性定位于肿瘤血管 引发血栓形成 尽管肿瘤未完全消退 但肿瘤生长速率降低了50 虽然tTF在心脏和肺也存在 但并未形成血栓 他们用抗磷脂酰丝氨酸 PS 的抗体进行免疫组化发现 肿瘤内表达VCAM 1的血管同时也表达PS 但心和肺中并无PS 于是他们得出血管表面的PS是凝血的必要条件 Nilsson等以抗纤连蛋白ED B区的抗体L19作为tTF的载体构建 表达融合蛋白 应用在小细胞肺癌的小鼠移植瘤模型上 结果显示融合蛋白能选择性诱导体内肿瘤血管内凝血 引起肿瘤缺血坏死 甚至导致肿瘤完全消失 AmrEl Sheikh等制备HBDt tTF融合蛋白注入荷瘤小鼠 能选择性引起肿瘤微血管迅速闭塞 显著消除肿瘤而不会引起正常组织的栓 Huang等把tTF连接到鼠的抗VEGF抗体上表达融合蛋白 在大肠癌小鼠模型进行体内实验 静脉注射该蛋白14d后 20 的小鼠肿瘤完全消失 相对于传统的药物靶向治疗 Huang等和Ran等认为以tTF为效应因子诱发肿瘤血管栓塞的抗肿瘤策略有以下几条优点 1 导向药物可以直接快速到达治疗部位 并允许药物在靶组织快速高比例分配 2 基于肿瘤组织血管栓塞的肿瘤细胞杀伤具有放大作用 3 血管内皮细胞属于基因稳定的正常细胞群 无抗原分子突变之忧 4 同一导向药物可适用不同的实体瘤 5 人源序列的TF没有免疫原性 现存的主要问题是受载体特异性及受体或抗原表达和分布特征的影响 单一载体靶向的tTF融合蛋白不能有效地阻断肿瘤组织的所有血供 到目前为止 研究的靶向标志物在炎症 组织修复或生理性血管生成部位都会表达上调 正如Dvorak所说 肿瘤只是未治愈的伤 但肿瘤血管靶向药物与正常组织反应是安全的 效应因子tTF本身无毒 所激发的凝血反应和血管血栓是人体的一种自然机制 tTF潜在的凝血酶原活性活化依赖于PS的存在 这使药物具有高度选择性 tTF融合蛋白选择性地作用于与血管内皮或可以与血液接触的靶分子 只需很少的药物就可达到很好的效果 并可以减少毒副作用 但其发展前景很有希望 技术路线 融合蛋白tTF EG3287的表达及其活性鉴定 优选工程菌tTF EG3287中的高表达株 优化IPTG诱导浓度和时间 目的蛋白的纯化和复性 蛋白浓度的测定 目的蛋白的活性鉴定 肿瘤动物模型的建立和融