帕金森病病人usp24基因外显子39～68突变筛查的论文【整理版】.doc

帕金森病病人USP24基因外显子3968突变筛查的论文帕金森病病人usp24基因外显子3968突变筛查【关键词】 帕金森病;usp24基因;突变【摘要】 目的 对帕金森病(pd)病人泛素特异性蛋白酶24(usp24)基因的外显子(exon)3968进行突变筛查，以进一步了解usp24基因是否为pd的致病基因。方法 对中国湖南省92例散发pd病人usp24基因的exon3968通过pcr产物直接测序法进行突变筛查。结果 在exon3968中未见任何碱基变异，在外显子内含子交界区检测出11种变异，其中3种为已知多态(rs6588545、rs12031876和rs10493176)，位于exon59的c.7078+22 a>g变异仅在1例以强直为主要临床症状的早发男性pd病人中存在，在95例正常人中不存在此变异。结论在湖南地区的中国人群中，usp24基因位于exon3968的基因突变可能在pd的发病机制中不起主要作用。 【关键词】 帕金森病;usp24基因;突变mutation screening of usp24 gene exon in patients o xiaoyun, chi jingedical geics of china, central south university, changsha 410078, china); abstract objective to screen the exon39-68 of usp24 gene in patients ethods mutation screening of exons39-68 of usp24 orphisms (rs6588545, rs12031876 and rs10493176). the mutation locating at c.7078+22 a>g of exon59 ale patient ain clinical symptom of stiffness, this variation al persons. conclusion the mutation locating in exon39-68 of usp24 gene seems not to play a principal role in pathogenesy of parkinson disease in chinese population of hunan region.key utation帕金森病(pd)是一种常见神经退行性疾病，遗传因素是其重要致病原因，迄今已定位了16个pd遗传易感位点，泛素特异性蛋白酶24(usp24)基因位于pd的park10遗传易感位点1。.li等2采用25个单核苷酸多态(snp)对pd病人usp24基因进行病例对照研究，发现其中6个snp在病人组与对照组间存在显著差异。尽管遗传学研究发现usp24基因可能参与pd的发病，但现有的研究仅用usp24基因相关的snp在pd病人与正常人间做关联分析，并未在pd病人中对usp24基因进行突变筛查。本研究首次在pd病人中对usp24基因的部分外显子(exon3968)进行突变筛查,进一步分析usp24基因是否参与pd的发生。1 对象与方法1.1 对象1.1.1 pd病人组 来自中国湖南省的汉族散发pd病人92例，由中南大学湘雅医学院神经内科唐北沙教授课题组收集，所有病人均经过至少2名经验丰富的神经内科医生严格的神经系统检查，诊断严格依据1992年英国脑库原发性pd诊断标准3。92例病人中，男53例，女39例;年龄为1870岁，平均(53.1414.96)岁;起病年龄为1368岁，平均(48.4315.04)岁;病程平均为(4.33.2)年。其中41例为早发性pd，起病年龄<50岁;51例为迟发性pd，起病年龄>50岁。82.61%的病人存在震颤症状，79.35%的病人存在肌强直症状，40.22%的病人临床上出现姿势反射受损，59.78%的病人存在运动过缓表现。其中33例病人临床表现以震颤为主，24例临床表现以强直为主。所有病人均在用药前采用hoehnyahr scale score分期(hoehnyahr)以及pd运动总分评级量表(updrs )来评估病人的病情严重程度及运动系统受损状况，本组病人的平均hoehnyahr评分为(2.340.87)分，平均updrs 评分为(27.2715.43)分。在早发pd病人中，parkin、pink1与dj1基因均无突变(结果来源于唐北沙教授课题组)。1.1.2 正常对照组 95例，分别由医学遗传学国家重点实验室及中南大学湘雅医院收集。其中男50例，女45例;平均年龄为(52.1713.32)岁。性别、年龄、居住地、民族分布均与pd病人组相匹配。1.2 方法1.2.1 外周血gdna抽提 常规采集两组外周静脉血10 ml，受检者均签署知情同意书。常规苯酚氯仿法抽提外周血淋巴细胞gdna。1.2.2 引物设计 对usp24基因exon3968以及这些外显子与内含子的交界区进行pcr扩增。采用primer 3.0在线软件(/cgibin/primer/primer3.cgi/)设计相应的pcr引物(序列见表1)，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。表1 usp24基因突变检测引物序列外显子正向引物反向引物1.2.3 pcr反应条件 采用热启动pcr反应程序在10 l反应体系中扩增各对引物，反应体系如下： 5106 u/l的hotstar polymerase (qiagen公司)0.25 l，10 mmol/l dntps 0.2 l，30 mg/l引物每条1.0 l，30 mg/l dna 模板 1.0 l，10buffer 1.0 l，q buffer 2.0 l，mgcl2 0.5 l，补去离子水至10 l。多数引物的pcr反应程序为：第一相循环，95 预变性15 min，94 变性50 s, 65 退火40 s，72 延伸50 s，循环6次，每个循环退火温度下降1 ;第二相循环，94 变性50 s，60 退火40 s，72 延伸50 s，循环25次，72 延伸5 min。取pcr产物2.0 l用60 g/l聚丙烯酰胺凝胶电泳40 min，并银染检测，对扩增特异性好的pcr产物用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶(fermant公司)37 酶切90 min, 80 15 min灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，将处理后的pcr产物使用3100基因分析仪(abi公司)进行测序。测序结果用dnastar软件中的seqman程序与参照序列(genebank accession number：nm_015306.2)进行比对分析。1.3 统计学分析使用spss 13.0统计学软件包中的fishers exact test分析等位基因频率和基因型频率在两组间的差别，以p<0.05为差异具有显著性。2 结 果在30个外显子(exon3968)中未发现任何碱基变异，仅在外显子内含子交界区检测到11种变异，见表2。其中，位于exon57的c.6882+71 a>t，位于exon59的c.697639 c>t及位于exon65的c.752718 a>g的3个变异均为dbsnp数据库中已报道的snp，其snp分别是rs6588545、rs12031876和rs10493176，其余变异均为dbsnp数据库中未报道的变异。所有变异或多态在病人中均以杂合状态出现。pd病人中这3个位点的基因型及等位基因频率与dbsnp数据库报道的正常人的基因型及等位基因频率并没有差别(见表3)。位于exon59的c.7078+22 a>g变异仅在1例以强直为主要临床表现的早发男性pd病人中检测到，在95例正常人中并未发现此变异。3 讨 论尽管pd的发病机制还不清楚，但目前认为遗传因素与环境因素的共同作用导致pd的发生。迄表2 pd病人中usp24基因exon3968突变检测结果外显子变异 dbsnp数据库录入号 变异频率表3 pd病人与正常人中usp24基因rs6588545、rs120今，在基于家系连锁分析的基础上已定位了16个pd遗传易感位点，克隆了11个pd致病基因，如：snca4、parkin5、lrrk26、pink17以及atp13a28等。已有研究结果证实，usp24基因位于park10位点9。由于usp24基因是泛素特异性蛋白酶家族的成员，具有将多聚泛素从靶蛋白上移走，防止靶蛋白被蛋白酶降解的功能，而蛋白酶解及蛋白聚集是pd发病的重要机制，因此usp24基因有可能参与pd的发生。li等2运用snp进一步的病例对照研究结果显示，usp24基因与pd的发生有关。以上两项研究均提供了usp24基因可能参与pd致病的遗传学依据，但由于病例对照研究的结果并不精确，它提示真正的致病变异可能与这些snp存在连锁不平衡，也可能是这些snp本身参与pd的致病，因此，对于usp24基因是否真的参与pd的发生，还需要对该基因的蛋白编码区、5及3utr区、甚至启动子和增强子、沉默子进行突变筛查分析，以明确pd病人中该基因在上述对基因功能起关键作用的区域是否存在变异。由于usp24基因的存在于2005年才得以证实，目前对它的启动子和增强子、沉默子所在区域还尚未确定，甚至近几年来它的外显子也是逐步被证实为目前的68个，因此，在我们第一阶段的研究工作中，先完成了对该基因exon3968共30个外显子的突变筛查。尽管li等2的研究仅选择了迟发的散发pd病人进行了病例对照分析，但oliveira等1在2005年的研究中，既纳入早发病人，也纳入迟发病人，因此在我们的研究中既包括了早发的pd病人，也包括了迟发的pd病人。本研究在对pd病人的usp24基因exon3968的突变筛查中，并未发现外显子的任何变异，仅在外显子内含子交界区检测到11种变异，可见该基因的exon3968蛋白编码区非常保守，也可能提示这段序列对维持usp24基因的功能非常重要。尽管我们的样本相对较小，但也在一定程度上提示usp24基因的30个外显子(exon3968)的基因突变可能在中国人群中对pd的发病不起主要作用。未来，我们还需要对usp24基因的exon138进行突变筛查，以进一步了解该基因5端的38个外显子有无氨基酸改变。目前我们所获得的exon3968突变筛查阴性结果的数据也可能是以下原因所造成。首先，我们的样本量相对较小，还不能很好地代表中国汉族pd病人的情况，在下一阶段的研究中还应该纳入更多的pd病人;其次，不论是li等2还是oliveira等1的研究样本均来自高加索白人，而我们的样本为中国湖南汉族人，不能除外种族异质性对usp24基因的影响，因此有必要在其他人种中对usp24基因进行突变筛查;最后，尽管我