血管内皮祖细胞(EPC)与自体骨髓干细胞移植ppt课件.ppt

血管内皮祖细胞 EPC 与自体骨髓干细胞移植 首都医科大学血管外科研究所首都医科大学宣武医院血管外科 吴英锋谷涌泉郭连瑞张建 1997年Asahara等首先描述了循环于外周血中的内皮祖细胞 endothelialprogenitorcell EPC 应用免疫磁珠法首先从外周血分离CD34 细胞 经在纤维连接蛋白 fibronectin Fn 预衬的培养皿培养 这些细胞转变成内皮特征细胞 意义 1 更正并充实了长期以来人们所认识的血管新生机制 2 为缺血性疾病及恶性肿瘤的治疗提供了新的靶点 血管内皮祖细胞 EPC 概念EPC又称为血管母细胞 成血管细胞 angioblast 是指能分化为血管内皮细胞的前体细胞 包括从血液血管干细胞 hemangioblast 到成熟内皮细胞之间的多个阶段的细胞 换句话说 EPC是向成熟内皮细胞分化过程中的具有特殊表型和特性的过渡细胞群体 血管内皮祖细胞 EPC 来源 一 普遍认为内皮细胞系与造血细胞系共同来源于中胚层的一种共同祖先细胞 血液血管干细胞 1 胚胎发育上的时空联系 在鼠胚7 5日龄 人胚13日龄胚外造血启动 卵黄囊的胚外中胚层聚集成血岛 bloodisland 位于血岛外层的细胞分化成原始的血管内皮细胞 血岛中央的细胞则变成原始的造血细胞 多个血岛腔隙相互联结成网状结构 形成原始血管床 此过程称之为血管发生 vasculogenesis 2 造血细胞与血管内皮细胞共同具有众多细胞表面标记 SCL TAL 1 CD34 VEGFR 2 GATA 2 PECAM 1 Tie 1 Tie 2和CD133等 3 某些胚胎源细胞的双系分化能力 有人用VE cadherin从胚胎中分离到不表达CD45和Ter119的 内皮细胞 发现该细胞可产生包括T和B淋巴细胞在内的造血细胞 证明了胚胎期内皮细胞系与造血细胞系的同源性 同时有实验表明 小鼠 鹌鹑 鸡的胚胎干细胞 Flk 1 细胞 Tie 2 细胞及VE cadherin 细胞在不同生长因子刺激下可同时产生造血和内皮系细胞 血管内皮祖细胞 EPC 来源 二 Reyes等人从人及啮齿类动物的骨髓中分离出一种多潜能成体祖细胞 multipotentadultprogenitorcell MAPC 细胞表型为CD34 HLA DR CD133 VEGFR 2 同时胚胎干细胞表面标记Oct 4 这种细胞增殖80代未见衰老 同时单个MAPC既能分化为中胚叶的肢芽组织细胞 脂肪细胞 基质细胞 成骨细胞等 又能分化为中胚叶的内脏组织细胞 内皮细胞 在VEGF诱导下 能产生CD34 VE cadherin flk 1 细胞 后者恰与EPC的表型一致来源 三 CD45 的单核 巨噬细胞来源 四 循环于血液中脱落的内皮细胞 图1EPC的来源 AB代表angioblasts 血管内皮祖细胞 EPC 分子标记及生物学特性从形态特征上不能与成熟血管内皮细胞区别近年来发现CD133在EPC表达而在成熟血管内皮细胞则无表达一般认为 早期EPC的三个表面标志性抗原 CD133 CD34和内皮细胞生长因子受体 2 VEGFR 2 后者在人类称KDR 在鼠类称flk 1 血管内皮祖细胞 EPC 分子标记及生物学特性骨髓中的早期EPC尚不表达VE cadherin和vW因子 在成体外周血中发现的EPC是较成熟的EPC 基本失去了CD133抗原但仍保留CD34和VEGFR 2阳性 外周血的EPC还以不同强度表达内皮系的其他标志分子 CD31 CD146 VE cadherin vW因子和内皮型NO合成酶等 成熟的血管内皮细胞 EC 则高表达VEGFR 2 VE cadherin和vW因子CD133抗原的丢失标志着外周循环中的EPC在向着成熟EC转化 血管内皮祖细胞 EPC 较高的数量和迟发的高增殖潜能实验证明 外周循环中成熟的EC数量极少 约2 6 1 6 2 3 个 ml 而EPC则约500 1000个 ml 两者比较相差悬殊成熟微血管内皮细胞在体外能很快进入增殖期 但4 6周 8 10代 后增殖活力即逐渐下降 与此相反 外周血 胎肝 骨髓来源的CD34 细胞在15 20天后形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞层 并能稳定传代30次以上 其增殖潜能是脐静脉内皮细胞的10倍 Lin等发现骨髓来源的EPC与EC体外扩增能力之比为50 1 血管内皮祖细胞 EPC 动员不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员许多生长因子 酶 配基及表面受体调节EPC的动员基质金属蛋白酶 9 MMP 9 的活化可能是动员的第一步其他促使动员的信号尚不清楚 但至少包括来自外周的促血管生长因素明显的例子包括肢体缺血 血管损伤 烧伤和冠脉旁路术后循环中EPC数量的迅速增加 这些事件都与内源性VEGF水平的增高有关 血管内皮祖细胞 EPC 分离EPC可从脐带血及成体外周血 胎肝 骨髓中获取目前 分离EPC的方法主要有以下两种 1 根据EPC表型用免疫磁珠法获得 先用Ficoll液密度梯度离心获取单个核细胞 然后用标记有相应细胞表面抗体的免疫磁珠将单个核细胞中的带有特定表面抗原的EPC筛选出来 一般选用CD34和 或CD133免疫磁珠 2 贴壁法特定培养基分化分离EPC 通过密度梯度离心得到单个核细胞后 把这些细胞接种在表面涂有胞外基质 主要用Fn 培养容器里 使用添加有特殊生长因子的培养基培养 这些特殊的促生长因子有VEGF 干细胞生长因子 SCGF 牛脑提取物以及复加bFGF IGF EGF ascorbicacid的混合物 EGM 2MV培养液 包含5 FBS VEGF hFGF b hEGF IGF 1 Hydrocortisone和Ascorbicacid等 Cambrex IMDM培养液 Hyclone DMEM完全培养液 中日友好临床医学研究所 FBS Hyclone Fibronectin Sigma Histopaque 1077 Sigma MTT Sigma Dil ac LDL BTI 抗 因子单抗 Zymed 抗flk 1单抗 SantaCruz 抗CD133单抗 MiltenyiBiotec APC标记的CD34单抗 BD FITC标记的CD133单抗 R D PE标记VEGFR 2单抗 R D 酶标仪 Pasteur 流式细胞仪 BectonDickinson Olympus倒置相差显微镜 Olympus普通光学显微镜 Nikon荧光显微镜 JEM 1010型透射电子显微镜 JEOL 贴壁培养材料和仪器 技术路线 Dil ac LDL摄取实验 培养48小时 可见长梭形 三角形 纺锤形或不规则形贴壁细胞呈集落样生长第9 11日 原代细胞汇合成层 近似单层铺路石状排列 结果 第48小时 200 EPCs原代汇合时 200 原代汇合时 平均每毫升骨髓可获细胞约 1 3 0 3 106细胞生长曲线第5代 细胞增殖明显减缓 结果 免疫细胞化学 TEM检测 ECEPCMSC 功能检测 绝大多数细胞呈阳性反应 EPC EC MSC Dil ac LDL摄取实验 增殖效率 新分离的BMMNCs CD34 VEGFR 2和CD133三个表面抗原均阳性的细胞占0 12 第10天 VEGFR 2和CD133双阳性细胞达29 03 增加了242倍 流式细胞术 目前 获取EPCs的方法主要有两种表面抗原分离法 具体采用免疫磁珠法获得离体扩增培养法表面抗原分离法不可能获得纯度较高的EPCs上述三种细胞表面抗原也同时存在于造血干细胞尚存在CD34 内皮祖细胞免疫磁珠法具有操作复杂 反复筛洗使获取细胞活性降低 费用高等缺点 不适于临床应用和大规模培养离体扩增培养法不仅可以克服上述缺陷 还因为BMMNCs中含有CD34 和CD34 细胞 共培养这些细胞还可促进CD34 的EPCs增殖 讨论 新分离的BMMNCs中的含有也同时表达上述三个表面抗原的HSCs 而扩增10日的贴壁细胞中不会含有HSCs 故实际扩增倍数要高得多免疫细胞化学和流式细胞术 因子亦呈明显阳性反应 说明EPCs在向成熟方向 ECs转化阳性细胞率不完全一致两种方法的敏感性不一致目前没有商品化的犬的单克隆抗体可利用胰蛋白酶消化贴壁细胞时也破坏了一定数量的细胞表面抗原 讨论 结论 1 应用离体扩增培养法可成功地从骨髓中分离培养并扩增出一个具有EPCs特征的细胞群体 单层鹅卵石样外观 CD133 因子相关抗原和VEGFR 2阳性 接近于ECs的超微结构 能够摄取Dil ac LDL这些细胞具有较高的增殖能力 胚胎干细胞向内皮细胞分化 1996年 VittetD等采用小鼠ESC定向分化产生血管内皮细胞2002年 LevenbergS等从人ESC诱导分化出血管内皮细胞ESC来源的血管祖细胞具有体内成血管作用 试剂配制 鼠ESC培养基 高糖DMEM 含15 FBS 胎牛血清 100mmol LNEAA 非必需氨基酸 0 55mmol L ME 巯基乙醇 0 1mmol LL GLU L 谷氨酰胺 105U LPS 青链霉素 使用前添加106U LLIF 白血病抑制因子 分化培养基 不含LIF的ESC培养基添加终浓度50ng ml的VEGF 血管内皮生长因子 VB分化培养基 不含LIF的ESC培养基 添加VEGF50ng ml bFGF 碱性成纤维细胞生长因子 100ng ml 细胞冻存液 50 ESC培养基 40 ES专用胎牛血清 10 DMSO 混匀后备用 现用现配 ESC的形态学观察 鼠ESC在饲养层上能保持未分化状态 细胞团形态呈鸟巢样 边缘清晰 单个细胞体积小 折光性强 核质比高 集落大小不等 与索条状的MEF分界清晰 未见分化细胞脱离饲养层细胞后 在LIF的作用下 集落周边可出现扁平的细胞突起 呈现出轻微的分化状态 200 200 ESC的鉴定 碱性磷酸酶检测 鼠ES细胞集落全部红染 为碱性磷酸酶染色阳性 100 ESC的鉴定 Oct 4 200 ESC的鉴定 SSEA 1 200 拟胚体形成 悬浮培养法 以0 25 的胰酶 EDTA消化接近完全融合的鼠ESC 离心去上清 重悬计数 将细胞悬液按不同的密度接种至低粘附的培养皿中 采用不同的培养基培养 观察细胞形成悬浮的球形细胞团 即拟胚体 embryoidbody EB 的数量及生长状态 拟胚体形成 悬浮培养法 Day2 Day9 Day4 Day12 200 ESC的分化诱导 简单两步法 第一步 EB形成 采用悬浮培养法第二步 EB的直接种植培养 取培养第4天的EB悬液 按50 100 l 孔用量移入0 1 明胶预衬的6孔培养板中 以分化培养基培养 每1 2天换液一次 换液时以PBS或Hanks液洗去未贴壁细胞 待细胞至70 80 融合时 进行消化传代 即为ESC ECP1 一般5 7天传代一次 多余细胞冻存 拟胚体的分化种植 将Day4的EB直接种植 采用分化培养基培养 6小时内即贴壁生长 24h后可见从贴壁生长的EB周围出芽样长出梭形或多角形细胞 向外放射状生长 并与周围集落融合 EBDay4 400 Day1 200 Day2 100 Day4 100 Day9 100 Day15 100 分化细胞的鉴定 DiI Ac LDL摄取实验 P9 P9 400 分化细胞的鉴定 DiI Ac LDL摄取实验 L929 阴性对照 400 分化细胞的鉴定 荧光双染 DiI Ac LDL摄取及FITC UEA 1 P1 400 分化细胞的鉴定 免疫组化染色 CD31 空白对照 400 P15 400 分化细胞的鉴定 免疫组化染色 Flk 1 空白对照 400 P15 400 分化细胞的鉴定 流式细胞仪检测 CD31阳性细胞比例逐渐增加 第2代 P2 时即可达71 7 82 4 平均76 6 P6时则达84 8 90 1 平均86 1 不断传代后最终维持在90 左右的较高水平 P2 P6 P9 分化细胞的鉴定 透射电镜检测 分化产生的细胞胞质内细胞器丰富 核周有散在的粗面内质网和丰富的糖原颗粒 线粒体甚为丰富 分化细胞的鉴定 透射电镜 细胞膜下及胞质内常见大小不等的吞饮小泡及多泡小体 分化细胞的鉴定 透射电镜 Weibel Palade W P 小体 是位于胞浆内的棒状呈束的微管 周围有单层膜包被 结论 2 采用简单的贴壁培养 单独采用VEGF即可成功诱导小鼠胚胎干细胞分化产生内皮样细胞 经传代培养后 分化细胞中CD31阳性细胞可达到90 以上 纯度高 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 血管新生 neovascularization 有三种方式 血管生成 angiogenesis 血管发生 vasculagenesis 和动脉生成 arteriogenesis 血管生成是指通过血管内皮细胞迁移 增殖 在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管 血管发生是指在原来没有血管系统的情况下 通过EPCs和造血干细胞产生血流的新通道传统观念认为vasculagenesis仅和angiogenesis共存于胚胎发育时期 而不参与出生后的血管新生 正是1997年Asahara等首先报道了 出生后血管发生 postnatalvasculagenesis 才使这一观念得以纠正目前认为 vasculagenesis和angiogenesis不仅共存于胚胎发育时期 而且还参与出生后的血管新生 图2血管生成和血管发生 EPC参与出生后诸多的生理过程补充血管壁脱落的EC女性子宫和卵巢的周期性变化都有血管发生的参与转基因小鼠的系统研究证明 在脑 肺 肝 肠 皮肤及肌肉的血管中都整合有一定的转化细胞 在排卵期的黄体和子宫内膜上尤为明显 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 EPC参与了出生后诸多的病理过程肢体缺血心肌梗塞肥胖相关疾病 型糖尿病 高血压 高血脂糖尿病视网膜病变肿瘤动脉粥样硬化 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 治疗性血管发生 therapeuticvasculogenesis 1999年 Isner等首先提出了 治疗性血管发生 的概念倡导以提高补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物 达到更好的血管新生效果 治疗缺血性疾病这一疗法充分利用成年机体血液循环中存在EPC EPC对缺血组织的自动趋化能力和归巢能力 EPC能分化形成血管的生物学特性 可以说是一个生理加强疗法 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 治疗性血管发生 治疗肢体缺血 图3 EPC功能分类 EarlyEPC 来源于CD14 细胞LateEPC 来源于CD14 细胞 MukaiN etal Experimentalcellresearch2008 314 430 440 治疗肢体缺血 大量的动物实验表明 外源EPC有助于缺血肢体模型的血管化hintani等用家兔下肢缺血模型研究 经血管造影 激光多普勒 缺血组织切片毛细血管密度观察 发现细胞移植组侧支血管形成及血管新生均有明显改善Crosby等用有基因组标记的转基因小鼠的胎肝细胞移植经射线照射的小鼠 随后在小鼠背部皮下植入小海绵 4周后取出海绵和一些未损伤的皮肤 动脉和脑标本制成切片 计数切片中总的内皮细胞 发现海绵中来源于供体EPC的内皮细胞占总内皮细胞数的8 3 11 2 而在正常组织中只占0 2 1 4 治疗急性心肌梗塞 心梗后坏死心肌不能停止疤痕化 存活心肌代偿性肥大 左心室结构重排 即 心室重建 最终发展为心衰EPC治疗急性心梗有很多成功的动物研究报道临床上Strauer用自体骨髓单个核细胞移植治疗一名大面积心梗的患者获得成功 植入的细胞成功的再造了被破坏的心肌组织和血管组织 治疗急性心肌梗塞 可能机理EPC在梗塞核心区以血管发生的方式形成新毛细血管和其它细胞共同分泌VEGF等生长因子 刺激梗塞边缘区健康小血管通过血管生成方式发芽生长在和有活力心肌细胞接触过程中 横向分化为心肌细胞参与重建 肿瘤细胞可分泌多种与血管生成有关的细胞因子如bFGF aFGF VEGF HGF和angiopoietin等 这些