Word版可编辑-核素示踪原理及试验设计精心整理.doc

第十二章 核素示踪原理及实验设计第一节 核素示踪的基本知识一、核素示踪原理所谓示踪法就是给被研究对象加上一个记号，以便在实验体系中或机体内追踪其行径与动向，了解被研究对象运转与变化规律。核素示踪法就是利用核素作示踪剂而建立起来的一种微量研究方法。目前绝大多数示踪实验都采用核素或其标记物作示踪剂。所以，通常所说的示踪实验往往是指核素示踪实验，以下便简称示踪实验。(一) 示踪实验（tracer experiment）的原理示踪实验的基础包括以下两点：其一是放射性核素和稳定核素及其标记化合物，虽与自然界中存在的相对应的同位素和化合物的物理性质不同，却具有相同的化学性质和生物特性。进入机体内后，在体内所发生的化学变化或生物学过程与被示踪的物质完全相同，这一性质在医学研究中非常重要。其二是放射性核素能自发地发生核衰变，同时发射出射线，利用高灵敏度的仪器，可对标记物进行精确的定性、定量或定位研究，而稳定核素由于质量不同于相应的同位素，可借助质量分析仪进行定量测量。上述两点结合起来，便成为建立示踪技术（tracer technique）的理论基础。(二) 应用及意义1935年Hevesy等研究放射性磷在小鼠体内的分布代谢过程时，便创建了人工放射性核素的示踪方法，它是一种具有实际意义的重要研究手段。尤其近10多年来在示踪法的基础上，又建立和发展了放射自显影、核素稀释法、活化分析技术、体外放射免疫分析等技术，并广泛地应用于免疫学、病理生理学、生物化学、药理学、药物代谢动力学、法医学、计划生育、遗传学、分子生物学等医学生物学的基础研究中。已揭示出的生物体内和细胞内的精细而又复杂的理化过程，对深入细致地研究正常或异常个体内物质代谢的各种问题（包括代谢转变的化学途径、速度；代谢产物在体内的分布、位置）及激素和维生素等重要物质的代谢起着推动作用。已阐明的蛋白质合成、核酸的结构等一些生物学中的最根本问题，为生命科学的研究开辟了新领域。此外，在当代新药研究中示踪技术也起着十分重要的作用。所以，示踪技术不仅是实验核医学研究不可缺少的方法，临床功能检查、脏器显像等技术的基础，同时也是医学生物学研究中的重要手段。二、示踪方法的特点核素示踪包括放射性核素示踪和稳定核素示踪，它们有各自的优点和不足。（一）放射性示踪方法的优点：（1）灵敏度高 目前最精确的化学分析水平为1012g，而放射性示踪法的分析水平可达101410-18 g，这对于研究体内或体外实验系统中微量的生物活性物质具有特殊价值。（2）测量方法简便 放射性核素衰变不受其他理化因素（温度和pH值）的影响，也不受样品中其他非放射性杂质的干扰，因此可省去分离提纯待测物的程序。尤其是用射线辐射体作示踪剂时，可直接从体表测量。这样，不仅可简化实验过程，又可减少实验误差。同时也是无创伤性的。（3）合乎生理条件 示踪方法是在示踪物质用量接近生理剂量的条件下，研究其在整体内的变化。这样少的物质不会干扰或破坏体内生理过程的平衡状态。这类的实验是合乎客观实际的。（4）能定位 示踪法不仅能准确地定量测量和进行动态研究，还可利用自显影方法确定标记物在机体器官组织内的分布和积聚。结合显微镜或电镜，可进行细胞水平或亚细胞水平分析，使结构与功能研究结合起来。（二）稳定核素示踪方法的优点（1）无辐射危害 适用于体内示踪，特别是孕妇和儿童使用时不需要防护设施。（2）稳定核素标记物不会发生辐射自分解，核素也不会衰变，因而无使用时间的限制，适用于实验周期长的示踪实验。（3）稳定核素一般无化学毒性。（4）稳定核素示踪方法不仅灵敏度、准确度高，尚能对标记原子的位置及标记化合物的分子结构进行分析。尽管示踪实验具有上述优点，在进行示踪研究中还应注意下列几点：操作人员的特殊训练；电子仪器和安全防护条件的配备及由同位素效应导致的错误结果。三、示踪剂示踪剂（tracer）是一些有特殊标记、很容易被测定并易与其他核素和化合物区分的核素及其标记化合物。放射性核素和稳定核素都可作示踪剂。前者由于核素发射出的射线，能比较容易地被放射性探测器定量地测定出来。而稳定核素由于质量不同于相应的元素，可借助质量分析仪，如质谱仪、气相层析仪、气-质联用仪、液-质联用仪和核磁共振仪等定量测定出来。四、示踪研究的基本类型根据示踪实验研究的性质，可将示踪研究分为两大类。（一）物理示踪此类示踪研究中所用的放射性标记物不是作为体内某一特定物质的示踪物，而是用作追踪物，研究其重量或物理变化，示踪物不参与化学过程或代谢过程。如利用放射性惰性气体从血流向肺内弥散的速度来判断肺组织的病理变化等，便属此类示踪研究的范畴。（二）化学示踪主要用于追踪某种物质在体内或培养体系内的复杂的生物化学行为，实验中标记化合物作为体内被测物质的示踪剂，要求其结构应与该特定物完全一样或十分近似，以保证两者生物特性相同或非常相似，以具有代表性。第二节 示踪实验设计的基本过程一、示踪实验的基本程序由于示踪实验的特殊性，除了遵循一般实验要求外，要根据实验目的和示踪实验的类型，考虑和解决示踪剂的选择、观察方法及数据处理等问题。所以，示踪实验必须按照一定的基本程序进行。（一）基本程序1实验准备阶段实验准备阶段是示踪实验过程中的重要阶段。主要对使用的示踪剂、研究对象、探测仪器、实验用具和试剂等实验条件进行准备。并通过预实验检查和完善这些条件。不仅如此，通过模拟实验（冷试验）可掌握操作技术和熟悉实验过程。此阶段可在小范围内进行活性实验，了解探测仪器的性能及确定示踪剂选择是否合适，防护条件和废物处理措施能否合乎要求等。不仅如此，在实验设计和预实验中，除设正常实验对照外，还应设放射性工作液的空白对照组分，以利于实验数据的纠正。总之，该阶段的最终目的是根据预实验得到的数据，调整与修改实验设计，完善实验方法，以保证正式实验的顺利完成，并强调实验过程的最优化和最简略化。2正式实验阶段它是实验研究计划和设计实施与完成的阶段。应在已确定的条件下，按具体的实验计划进行工作。尤其是示踪剂的使用、样品的收集与制备以及放射性测量都要求按计划进行。若必须修改实验方案时，应注意实验的连续性和可比性。在此阶段中，与预实验一样，必须认真作好详细的实验记录，包括实验步骤、测量结果。意外现象也应详细记录。3实验总结阶段该阶段的任务是按照研究设计的要求，认真检查与归纳原始资料，使之系统化、条理化。尽量地减少或消除整理引起的误差。并根据指标进行数据计算，找出事物的内在联系，得出最后的结论。对于大量放射性测量数据的计算、整理与比较，可利用计算机的专用程序来完成。但应指出，示踪实验中，有时需要进行放射性计数校正和特殊数据计算，或因实验数据不足，需作补充试验和进一步的数据分析，以获得正确的实验结论。4实验的善后处理阶段示踪实验不同于一般实验，尤其是放射性示踪实验，实验中产生各种放射性废物必须妥善处理，要根据使用核素的核性质、半衰期和化学性质等，并根据国家的相关法规和政策选择适当的方式方法。所以，实验结束后的处理工作，仍是整个实验的一部分。并且，放射性废物的处理及放射性污染与防护，应当在整个实验过程种都予以高度重视。（二）示踪实验设计的基本要求1放射性示踪实验设计的基本要求（1）放射性核素的选择 放射性核素的选择在示踪实验中是非常重要的。这种选择不仅在取决于实验的要求，还取决于核素的放射化学性质。所以，实际上应综合两方面的要求，去确定放射性核素选择的基本原则。辐射类型：在示踪实验中，由于发射a粒子的核素，半衰期极长，测量困难，生物示踪实验中很少应用。一般多选用发射- 粒子和 g 射线的核素，- 射线因能量不同，分为低能的软- 射线 (3H、14C、35S、45Ca)和高能量的硬-射线（32P），离体实验和各种代谢研究多选用发射- 粒子的核素。体内诊断性示踪实验体外测量，主要选用发射射线的核素作示踪核素。半衰期：也是放射性核素选择的标准之一。要挑选具有最适宜的半衰期的核素，它应足够长，以满足实验周期的要求；同时又要足够短，便于放射性废物的处理。整体实验时除考虑放射性核素的物理半衰期（Tp）外，还需考虑它的生物半衰期（Tb）。根据公式（12.1）， （12.1） 若Tp与Tb相差20倍以上时，其有效半衰期（Te）基本等于其中那个短的半衰期。例如，14C标记物（Tp=5,730 a，Tb=10 d）所以能够作为示踪剂被安全地使用于体内和临床就是这个缘故。（2）放射性核素标记的位置 当研究物质转运规律时，追踪观察的是原示踪物的去向，而不是追踪其代谢产物，故只要求标记原子牢固便可。又如研究氨基酸脱羧基反应，应将示踪原子牢固地定位标记在羧基上，否则在实验过程中会脱离化合物，失去实验意义。有些实验不要求特殊定位标记的化合物，可采用均匀标记。可是在使用均匀标记物时，要尽量除去化合物中不稳定位置上的标记原子，以免造成实验误差。（3）示踪剂要有足够的放射性核素纯度、放射化学纯度（放化纯度）和比活度 为避免不同放射性核素的干扰，减少对实验对象的不必要的照射，要求放射性示踪剂的放射性核素纯度应达到规定的标准，即98以上。在使用其标记化合物时，也应满足规定的纯度，即放化纯度为95以上。此外，放射性示踪剂应有相当高的比活度，这是因为示踪剂引入研究体系或机体后立即被稀释。如示踪剂比活度太低，为满足测量的要求，引入的化学量必定会大大超过生理剂量，使实验结果失去真实性。另外，有些示踪实验中，要求使用无载体的示踪剂，尤其当所研究的物质含量甚微时，载体的有无或其量的多寡，都能影响原有物质在体内的平衡。（4）示踪剂剂量的选择 主要依据标记化合物的放射性比活度、放射性核素的半衰期；标记化合物在研究系统中或机体内被稀释的程度、利用率及在机体内的分布和排泄特点；实验周期、测量仪器的探测效率和示踪剂安全使用范围等因素。一般要求在整个实验中示踪剂被稀释后，样品脉冲计数率应5倍于本底计数即可满足要求（见第一章）。在实际工作中常用下式估算示踪剂的剂量： （12.2）A为示踪剂的比活度，B为本底计数，C为原示踪剂的用量，D为稀释倍数，E为探测效率。一般来说，小动物实验的用量在7.418.5 kBq（0.20.5 Ci）范围内，更多的是在370 kBq（10 Ci）以下。离体实验如细胞培养、切片保温、酶反应等示踪实验，用量可小于37 kBq（1 Ci）。（5）示踪剂的给予途径 整体动物实验的给药途径，和其他非放射性实验一样，不外乎经口、静脉、腹腔、皮下或肌肉注射。一般给药量小，要求体积准确。应防止损伤或漏出造成的污染。离体实验要根据研究目的，严格控制引入示踪剂的时间。（6）样品的采集与制备 样品的采集要有代表性；脏器采样应固定解剖部位，同时要避免与其它他脏器和血液接触造成污染。进行代谢研究时，动物要饲养在代谢笼内，尤其是注射挥发性的放射性核素时，应有专门的气体收集装置。此外，还要注意的是样品的采集与制备须在相同的条件下进行，以免带来人为的误差。（7）放射性测量方法的选择 不同能量的射线应采用不同的测量方法，如射线的测量，主要选用碘化钠晶体闪烁计数器。32P的测量可用G-M计数管，而目前多用液体闪烁计数器；而低能核素3H、14C则用液体闪烁计数器或薄窗G-M计数管进行测量；射线可用带有硫化锌晶体的闪烁计数器、电离室和核乳胶测量，也可用液体闪烁计数器测量。2稳定核素示踪实验设计的基本要求（1）核素的选择 可供示踪实验用的稳定核素有：2H、13C、15N、18O。但由于合成方便和费用低，氘成为最常选用的核素。（2）示踪剂量 与放射性实验相比，稳定核素标记物的使用剂量较大。有时采用化学剂量，这在一些示踪动力学实验中应慎重考虑。（3）丰度 示踪实验中不仅要求使用高纯度的标记物，同时也要求使用高丰度的稳定核素。丰度愈高，用量就愈小，可以避免过大剂量示踪剂对机体生理状态的影响。另外，丰度高也能经得起最大限度的稀释，并能提高实验的准确性。此外，稳定核素示踪实验和放射性核素示踪实验一样。要求尽量缩短从取样到分析的时间，可避免同位素的“污染”。再者，还应注意实验中标记原子的丢失，特别在物质转化研究中更应给予充分的重视。二、示踪实验的基本方法示踪实验按照不同的实验目的和实验方式可分为两大类：离体示踪实验和整体示踪实验。（一）离体示踪实验（in vitro）它是指用由整体中分离出来的简单系统进行的实验，如长期培养的细胞株、无细胞酶系统、短期孵育的细胞悬液或组织切片及灌流器官。此类实验主要用于揭示物质（包括大分子）的转化、精细的结构及神经递质的释放与摄取的关系。所以在研究物质代谢、受体与配基相互作用时，应首先考虑选用此类示踪实验。由于离体示踪实验的分析系统简单、示踪物和转化物的浓度不会遇到运转、排泄等因素的影响，所以，实验结果准确性高，分析方法也比较简单；同时离体实验条件能够人为地加以控制，因此，它更适合于各种精细的分析研究。然而，离体实验的条件明显地不同于整体实验，其实验结论不一定能够外推到整体情况。可见，对离体示踪实验的结果进行整体示踪实验验证是必要的。离休示踪实验根据示踪剂的使用方法又分为两种类型：1恒量标记实验多数离体示踪实验都是向实验系统中加入过量的示踪剂，实际消耗量极少，在整个过程中示踪剂的浓度基本一致，分析结果时毋须考虑示踪剂的浓度变化，故称为恒量标记实验。此类方法常用于研究离子转移规律和DNA合成速度等。2脉冲标记实验这种示踪实验方法只允许被研究系统与示踪剂接触一个短暂时间，随即将示踪剂除去，再继续观察。如细胞的增殖动力学研究和活性肽的代谢研究等。（二）整体示踪实验(in vivo)整体示踪实验是将标记物引入完整的机体内，从体表或定期取样研究标记物的运转与分布。这类实验方法主要用于研究物质的吸收、分布、转运和排泄等运动规律，或对某些生理器官功能的研究。此类实验方法虽不如离体示踪实验精细，但却能反映机体的实际生理情况。因此，常用来对离体实验结果进行验证。整体示踪实验中，除吸收途径研究外，通常采用静脉注射引入示踪剂（小动物实验常采用腹腔注射）。静脉注射方式分一次性快速注射和恒速滴注两种。示踪剂的浓度在血液、组织及代谢物中都呈现出时相变化（图12-1，图12-2），这是机体内复杂代谢过程综合影响的结果；血液中示踪物的浓度不仅取决于它的吸收，也取决于它在体内的代谢转化和排泄。甚至有的物质可能有体内反馈（如标记氨基酸进入蛋白质又分解出来）。所以，在设计这类实验时，必须同时考虑对比研究血液和组织中原示踪剂与标记代谢产物的放射性活度的变化。在处理分析实验数据时，还应作必要的复杂的数学运算。否则难以得到正确的结果。189图12-1 静脉一次性快速注射放射性示踪剂在血液（）、组织（）、代谢物（）中的时相变化 图12-2 静脉恒速滴注放射性示踪剂在血液（）、组织（）、代 谢物（）中的时相变化三、示踪实验资料的整理与分析示踪实验资料的整理和数据分析是整个实验计划不可缺少的组成部分。应指出由于示踪实验的特点，必须在确保标记物起到真正的示踪作用、量具与探测仪精度高、严格控制各种变异因素和测量数据可靠的前提下，才能对示踪实验资料进行统计学分析处理。具体的统计分析处理方法见第一章，这里只强调了三个须注意的问题。（一）两个计数率的显著性检验在放射性测量工作中，经常比较两个计数率的差别，如比较两个样品的净计数率，或同一样品两次测量的计数率等。若两个计数率有差别时，首先应确定两个计数率的差别不是由放射性衰变所致，才能作出两个计数率有差异的结论。工作中常用u检验方法进行判断（见统计学）。（二）可疑值的舍弃在分析测量结果时，可能发现有的数据与均数的相差甚大，怀疑是否能从泊松分布中获得如此结果，便可用c2检验法或Chauvenet判断标准等方法验证。（三）误差传递在放射性计数处理过程中，有的结果不是直接测量得到的，而是间接地由一些计数结果经加、减、乘、除等运算得到的。其中，每个计数结果都存在统计误差，各原始测量数据的误差又会传递到最终结果上。所以，在进行数据运算时应严格控制计算误差。否则，会影响最后的实验结论。第三节 双标记示踪实验一、双标记示踪实验的原理与用途（一）双抗记实验双标记示踪是指用一种或两种不同的核素标记不同种类的化合物、或同种化合物进行的示踪实验，这类实验称为双标记实验。（二）双标记实验的原理双标记示踪实验的基本原理可概括如下：作为示踪剂的两种化合物分子，或一种分子的两种形态（如一种药物的两种剂型），或是一种分子的两个基团，分别带有标记原子，这两种原子的放射性活度或质量的差别能被有效地分别测量出来，经统计分析找出它们转化前后比值的变化，以说明被观察的对象变化规律的异同。（三）双标记实验的用途双标记实验的用途广泛，尤其是在物质的代谢研究中，是单标记实验无法取代的。此类实验常被用来研究某一化合物分子上不同的原子或基团的各自代谢情况，观察两种相关化合物的吸收、分布、排泄等方面的异同；还可用来研究两种代谢产物在代谢过程中的相互转化。此外，在药物研究中，常需用双标记实验进行回收校正。由此可见，双标记实验是基础医学研究中不可缺少的手段。二、双标记示踪实验的设计和其他示踪实验一样，应根据实验目的与要求进行实验设计。因为实验中涉及两种不同的示踪物。所以在实验设计中应注意下列问题：（一）标记化合物大多数实验不需要分子内双标记示踪物，而是用相互混合的两种单标记物作双标记实验的示踪剂。适合双标记用的、成对的放射性核素有3H与14C、3H或14C与32P、32P与45Ca、32P与125I、24Na与36Cl、55Fe与59Fe、125I与131I等。上述放射性核素不仅可发射出能量明显不同的- 射线与电子（e-），其半衰期也有较大的差别。近来，由于稳定核素分析技术的发展，还可以采用放射性核素与稳定核素的双标记物或两种不同的稳定核素的双标记物。（二）示踪剂剂量的配比由于大多数实验中采用两种单标记化合物混合物，如何分配两种标记物用量是实验的关键。实验中能有效地分别测量，首先取决于两种标记原子放射出的射线的能量。有资料证明，液体闪烁计数器能同时测量能量相差4倍以上的两种- 射线。 然而高能核素标记的化合物，由于比活度太高也会影响低能核素测量的精确度。因此，常在保持最小测量误差的条件下，可按照两种放射性核素各自的探测效率和在体内消失的速度去估算所需的用量，并应通过验证确定两者最合适的剂量比例。（三）双标记测量液闪探测技术是放射性核素双标记示踪实验的重要测量手段，是利用液体闪烁计数器分辨能量的本领进行双标记测量的。除此之外，也可利用双标记核素半衰期的不同，或发射的射线类型不同，采用相应的仪器进行测量。对稳定核素的测量，常借助有机质谱仪来完成。第四节 同位素效应问题一、同位素效应的概念在示踪实验中，由于使用的同位素质量的不同而引起物质转化反应速度的变化，称为同位素效应（isotope effect）。如在研究物质转化时，由于被研究的物质分子中某一原子由它的同位素所取代，便可引起反应速度的变化，所以在示踪动力学的更新速率研究中，同位素效应不可忽略。否则会影响最终结果。氢的同位素效应研究较多，部分原因是因为氕（H）、氘（D）和氚（T）的质量差别大，比较容易观察到较大的效应；另一方面是因为质子转移反应在化学和生物学中普遍存在而且具有十分