NGS系列讲座——NGS基本原理.ppt

NGS系列讲座 一 NGS简介及原理 2017 06 01魏冬凯 Outline 二代测序技术背景Solexa测序原理 Outline 二代测序技术背景Solexa测序原理其他平台测序技术简介 什么是DNA测序 测序的研究对象是什么 DNA测序 DNAsequencing 或译DNA定序 是指分析特定DNA片段的碱基序列 也就是腺嘌呤 A 胸腺嘧啶 T 胞嘧啶 C 与鸟嘌呤的 G 排列方式 百度百科 测序主要研究的是DNA一级结构 不涉及DNA的二级 三级结构 DNA合成的基本过程 dNTP ddNTP 一代测序 末端终止法 ABI3700 使用特异性引物与单链模板DNA退火 在DNA聚合酶作用下进行延伸反应 用ddNTP终止 用荧光染料标记4种不同的碱基 通过计算机自动读出 Frederick Fred Sanger Sanger测序 Sanger测序 GTCTTGGGCT Sanger测序 GTCTTGGGCTAGCGC 21bp Sanger测序 GTCTTGGGCTAGCGC 5 TGCGCGGCCCA 21bp 26bp GTCTTGGGCTA Sanger测序 GTCTTGGGCTAGCGC 5 TGCGCGGCCCA 21bp 26bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTTGGGCTA 22bp G Sanger测序 GTCTTGGGCTAGCGC 5 TGCGCGGCCCA 21bp 26bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTTGGGCTA 22bp 5 TGCGCGGCCCA G 12bp GTCTTGGGC Sanger测序 GTCTTGGGCTAGCGC 5 TGCGCGGCCCA 21bp 26bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTTGGGCTA 22bp 5 TGCGCGGCCCA G 12bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTTGGGC 20bp GTCTT Sanger测序 GTCTTGGGCTAGCGC 5 TGCGCGGCCCA 21bp 26bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTTGGGCTA 22bp 5 TGCGCGGCCCA G 12bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTTGGGC 20bp 5 TGCGCGGCCCA GTCTT 16bp Sanger测序 C 5 TGCGCGGCCCA T 21bp 26bp 5 TGCGCGGCCCA A 22bp 5 TGCGCGGCCCA G 12bp 5 TGCGCGGCCCA C 20bp 5 TGCGCGGCCCA T 16bp Sanger测序 LaserReader Sanger测序 Sanger测序的特点 测序长度500 1000bp 通量低 每次测序最多获得1kb数据 如果测大基因组 成本极高 错误率高 PCR带来错配 测序基于PCR反应 需要引物 并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序 1990年10月美国确定把当年的10月1日作为官方实施HGP的起始日期 被誉为生命科学 阿波罗登月计划 的国际人类基因组计划启动 2000年完成草图 2003年正式完成 全部人类基因组约有2 91Gbp 约有39000多个基因 目前已经发现和定位了26000多个功能基因 耗时13年 30亿美金 人类基因组计划 HGP 1977年 2005年 Roche454 2006年 IlluminaGA 2007年 ABIsolid 2008年 Helicos单分子测序仪 2009年 Pacific单分子测序仪 第一代 第二代 第三代 二代测序技术的出现 鸟枪法 基因组 基因组片段 鸟枪法 基因组片段 通过剪切力 超声 酶切等打断基因组 ATTGTTCCCACAGACCG CGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG TTTCCGACCGAAATGGC TTGTTCCCACAGACCGTG AGCTCGATGCCGGCGAAG ATGCCGGCGAAGCATTGT TAATGCGACCTCGATGCC ACAGACCGTGTTTCCCGA AAGCATTGTTCCCACAG TGTTTTCCGACCGAAAT CCGACCGAAATGGCTCC TGCCGGCGAAGCCTTGT 基本测序思路 ATTGTTCCCACAGACCG CGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG TTTCCGACCGAAATGGC TTGTTCCCACAGACCGTG AGCTCGATGCCGGCGAAG ATGCCGGCGAAGCATTGT TAATGCGACCTCGATGCC ACAGACCGTGTTTCCCGA AAGCATTGTTCCCACAG TGTTTTCCGACCGAAAT CCGACCGAAATGGCTCC TGCCGGCGAAGCCTTGT TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC 基因组 基本测序思路 ATTGTTCCCACAGACCG CGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG TTTCCGACCGAAATGGC TTGTTCCCACAGACCGTG AGCTCGATGCCGGCGAAG ATGCCGGCGAAGCATTGT TAATGCGACCTCGATGCC ACAGACCGTGTTTCCCGA AAGCATTGTTCCCACAG TGTTTTCCGACCGAAAT CCGACCGAAATGGCTCC TGCCGGCGAAGCCTTGT TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC 基因组 基本测序思路 Outline 二代测序技术背景Solexa测序原理其他二代测序平台技术简介 Solexa测序的关键技术 Illumina 桥式PCR Solid phasebridgeamplification 4种标记过的核苷酸 可逆终止反应ReversibleTerminatorChemistry Solexa测序的关键技术 Illumina 桥式PCR 准备DNA片段 两端接上adapters 桥式PCR 准备DNA片段 两端接上adapters 将DNA片段通过adapter锚定在芯片上 循环扩增DNA片段成 DNA簇 桥式PCR Firstbaseincorporated Cycle1 Addsequencingreagents DetectSignal CleaveTerminatorandDye Cycle2 n Addsequencingreagentsandrepeat 边合成边测序 SequencingBySynthesis SBS TTTTTTTGT TGCTACGAT 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列 转换成相应的DNA序列 Solexa测序原理 测序种类 Single ReadSequencing SR 测序种类 Single ReadSequencing SR Paired EndSequencing PE 测序种类 Single ReadSequencing SR Paired EndSequencing PE 测序种类 Single ReadSequencing SR Paired EndSequencing PE IndexSequenc