决赛论文——金鱼草

活性氧在金鱼草切花向重力性反应中的信号转导作用作者姓名：刘华明 范 玉 李韵琦 陈会星 李茂指导老师姓名：张昭其华南农业大学园艺学院，广州，510642摘 要向重力性反应是导致金鱼草等切花商品价值降低、包装运输成本高的重要原因。植物的向重力性反应是一个复杂的生理生化过程（包括了重力刺激生物信号反应生理反应上下侧生长素含量的不同外观弯曲现象）。因此研究金鱼草向重力性问题在理论和实践上都具有重要意义。有研究表明活性氧被认为参与了植物的向重力性反应，活性氧被认为是细胞信号转导和调控组成成分，参与了生长素介导的细胞伸长。而许多研究又表明Ca2+参与了植物向重力性反应的各个环节。本文从这个角度出发，采用能激发植物内源H2O2产生的水杨酸（SA）、过氧化氢酶（CAT）的抑制剂氨基三唑（AT）、NADPH氧化酶抑制剂Imadizole（Im）及一氧化氮释放剂硝普钠（SNP）处理采后金鱼草切花，研究这些药剂处理抑制金鱼草向重力性反应中的效果及生理作用，并从生理和分子水平讨论4种主要的抗氧化酶CAT、APX、NADPH氧化酶、HATP酶与活性氧信号及金鱼草向重力性的关系，从分子水平探讨钙信号相关基因CDPK、CAM 与向重力性反应的关系，生长素相关基因PIN、EXPANSINS、 与向重力性反应的关系，同时对H2O2信号与钙信号在向重力性反应中的相互作用进行初步探讨。目前主要研究结果如下：1通过AT、SA、Imidazole、SNP等活性氧诱导剂和抑制剂不同浓度处理，观察诱导和抑制效果筛选适合浓度；2通过使用测得的AT、SA、Imidazole、SNP等药剂的最佳浓度处理金鱼草切花，取适量样品放入超低温冰箱保存，用来测相关酶类和基因克隆表达；3进行NADPH氧化酶活性变化、活性氧含量等指标的测定；探讨活性氧与生长素积累和扩展蛋白的关系，SNP（硝普钠）与金鱼草向重力性的关系；4完善整理试验数据，撰写分析报告。关键词：杨酸（SA） 氨基三唑（AT） Imadizole（Im） 金鱼草 向重力性12目 录1 前言32 材料与方法32.1 金鱼草标本的采集32.2 方法32.2.1 酶测定方法32.2.2 基因的快速提取（CTAB法）42.3 实验药品42.4 实验材料42.5 实验材料处理42.5.1 金鱼草切花处理42.5.2药剂浓度筛选42.6 经药剂处理后切花形态特征的观察42.7生理指标的测定42.8 数据处理43 结果与分析43.1 药剂处理后的金鱼草切花向重力性的表现43.2各项指标的测定63.2.1 APX活性的测定63.2.2 H2O2含量的测定63.2.3 O-活性的测定73.2.4 NADPH活性的测定73.2.5过氧化物酶（POD）活性的测定73.2.6 CAT活性的测定73.2.7丙二醛（MDA）含量的测定73.3 结果分析83.3.1 活性氧基因的提取与测定83.3.2 SA、SNP药剂处理与H2O2含量的变化83.3.2 SA处理对CDPK和CAT基因表达情况93.3.2 SNP处理对CDPK和CAT基因表达情况10参考文献111 前言金鱼草（Antirrhinum majus L.）为玄参科秋播一年生草本，因花似金鱼，故得名。金鱼草色彩丰富，除蓝色外，其余各色齐全。近年来培育出很多多倍体品种及优良的一代杂种，不仅花大而密、色彩艳丽、茎杆粗壮高大，而且耐寒性、抗病性都强，收成稳定。作为切花，金鱼草通常在12月-翌年4月上市。金鱼草花形奇特，花色浓艳丰富，花期又长，是园林中最常见的草本花卉。国际上广泛用于盆栽、花坛、窗台、栽植槽和室内景观布置，近年来又用于切花观赏。因此，在金鱼草的品种改良上进展很快，其中以美国发展最快，至今金鱼草有矮生种、半矮生种、高秆种以外，又有10厘米株高的超矮生种，有许多属四倍体品种。近来又选育出重瓣的杜鹃花型、蝴蝶型的新品种。美国的戈德史密斯种子公司在金鱼草的育种上最有成就。在金鱼草的生产上，在欧洲的丹麦、瑞典、挪威、荷兰、比利时等国主要以盆栽和花坛植物为主，也有切花生产。在日本主要生产盆花，少量生产切花。然而，金鱼草切花在水平装箱运输过程中，常发生花茎向上弯曲的现象，导致商品价值降低（高俊平，20031）。这样的现象被称为“向重力性反应”。这类切花包装时需要垂直放置于专门设计的包装箱中，大大增加了鲜切花的包装运输成本。因而，我们需要找出抑制其向重力性反应的办法，并通过测试经过处理后的氧化酶活性的变化及活性氧含量等生理指标，从而得出其反应的机理。2 材料与方法2.1 金鱼草标本的采集从岭南花卉市场中国芊卉集团广州切花部购买头一天晚上采收第二天凌晨空运到广州的有46朵小花开放的金鱼草切花，运回实验室，修剪切花基部，保持每支切花约50cm长，垂直插于盛有400ml蒸馏水的2L的量筒中过夜，所有切花即呈直立状态。2.2 方法2.2.1 酶测定方法抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性参照沈文飚等2（1996）和刘祖棋等3（1994）的方法测定；丙二醛（MDA）的含量参照刘祖棋等3（1994）的方法测定；过氧化物酶（POD）的活性参照曾韶西等（1997）的方法测定；过氧化氢酶（CAT）的活性参照戴宏芬（1991）的方法；H2O2含量测定方法参照周碧燕（2006）的方法并有所改动；细胞膜NADPH氧化酶活性参照按Sagi和Fluhr（2001）的方法进行测定。2.2.2 基因的快速提取（CTAB法）2.3 实验药品AT,SA，Imidazole，SNP等活性氧诱导剂和抑制剂；2.4 实验材料本实验中所用金鱼草为车前科（Plantaginaceae）金鱼草属（Antirrhinum）。2.5 实验材料处理2.5.1 金鱼草切花处理第二天将垂直处理后的金鱼草切花取出，再把切花修剪成25cm长，插于盛有各种处理液（参照后面实验材料药剂处理方法）的1L的塑料量筒内，垂直或水平放置于实验台上（即给予重力性刺激）。金鱼草切花具有特定的向重力性反应部位，该部位位于花序顶部以下510cm的花茎，分别取该部位的上下侧的皮层组织，于药剂处理的0、0.5、1、2、4、8h取样供指标测定。2.5.2药剂浓度筛选利用AT（氨基三唑）（mmol/L）、MJ（茉莉酸甲酯）（mmol/L）、SA（水杨酸）（mmol/L）、 Imidazole（NADPH）抑制剂（mmol/L）和SNP（硝普纳）（umol/L）等进行处理，对于各个药剂都通过设置浓度梯度筛选出最优的浓度。2.6 经药剂处理后切花形态特征的观察将切花放入已设计好的浓度梯度药剂中，然后观察得出不同药剂在处理后0、0.5、1、2、4、8h的金鱼草先端的弯曲程度，以及处理后金鱼草花蕾有无特殊变化，从中得出最有效的弯曲抑制剂浓度分别为。1mmol/L SA、0.2mmol/LSNP、15mmol/L AT以及50mmol/LIm2.7生理指标的测定得出有效的药剂浓度后，我们将选择该浓度下进行处理，并切取该部位位于花序顶部以下510cm的花茎，分别取该部位的上下侧的皮层组织，于药剂处理的0、0.5、1、2、4、8h取样供指标测定。测定的指标包括MDA含量、H2O2含量；测O-2含量；测OH-含量、APX，CAT、NADPH 氧化酶活性、Ca2-ATPase活性、生长素含量、Exp扩展蛋白、H-ATPase、ARF、PIN、Ca-ATPase、NADPH 氧化酶等2.8 数据处理数据分析用DPS统计软件进行分析。3 结果与分析3.1 药剂处理后的金鱼草切花向重力性的表现通过外观观察对金鱼草向重力性影响效果，我们筛选得到了最佳的活性氧诱导剂和抑制剂的浓度。图1 经SA处理后4小时金鱼草茎段弯曲情况对照通过观察我们可以发现，经1mmol/L SA处理4h后金鱼草切花的弯曲度明显交CK（没有药剂处理的金鱼草切花）低，而且我们还可以发现，随着SA浓度的增加，金鱼草切花的弯曲受到的抑制越明显。更重要的是再经过药剂SA处理后，金鱼草的花苞能正常开发，花瓣颜色无受损表现。图2 经SNP处理后4小时金鱼草茎段弯曲情况对照通过SNP处理4h后的金鱼草切花弯曲度对比，我们发现0.2m和0.5m的SNP处理效果都十分明显，但在处理后我们发现0.5m的浓度对金鱼草的花苞有伤害作用，花瓣边缘出现褐变，花苞开发受抑制。而0.2m浓度处理下的切花无该现象出现，所以我们认为0.2m的SNP效果更优。图3 经AT处理后4小时金鱼草茎段弯曲情况对照通过AT处理4h后的金鱼草切花弯曲度对比，我们发现15m的AT对金鱼草弯曲的抑制效果最明显，并且对切花没有表现出现损害现象。图4 经Im处理后4小时金鱼草茎段弯曲情况对照通过对比CK与药剂Im处理4h后的金鱼草切花弯曲度，我们发现随着Im浓度的上升，其对金鱼草弯曲的抑制效果就越明显，但高于50m时则会出现对切花损伤的情况，所以我们决定选择50m作为最终的处理浓度，并测试其处理下的金鱼草切花的生理指标。3.2各项指标的测定通过以1mmol/L SA、0.2mmol/LSNP、15mmol/L AT以及50mmol/Lim浓度处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h下的金鱼草切花进行适量的取样工作。随后测定其上下表皮的酶活性的变化值和提取活性氧相关基因的片段序列。3.2.1 APX活性的测定提取1g金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮，液氮研磨，加5 ml酶提取液(50 mM PBS,pH 7.0, 2mM AsA, 5mM EDTA，现配现用)，12000 rpm 于4下离心20min，得上清酶液5 ml左右，置冰浴中待用。先在比色皿中加入100ul的酶液，再加入2.75ml反应液（含50 mM PBS,pH7. 0, 0. 1 mMEDTA，0.3 mmol/L AsA），最后加入150ul0.1% H2O2启动反应，在290nm处测定OD290值变化，以OD290每分钟减少0.001表示一个酶活力单位（U）,酶的活性以Ug-1FW表示，重复3次。3.2.2 H2O2含量的测定参照周碧燕（2006）的方法并有所改动。取金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮1g，加入5ml 5% 4三氯乙酸（TCA）和0.2g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），液氮或冰浴研磨，12000 rpm 于4下离心20min，上清液调pH值至8.4（25%氨水（200ul左右）2M乙酸），（过滤并用少量的5%TCA洗脱吸附在滤纸上的残余的溶液，）并用pH 8.4的TCA定容至6ml。取1ml上清液，30水浴30min，加入1ml显色液于500nm处比色，以1ml上清液中加入10ug过氧化氢酶作为空白，记录OD值，重复2次。从标准曲线上查OD值所对应H2O2数值，然后计算H2O2含量。3.2.3 O-活性的测定取1g金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮，液氮研磨，加50mM磷酸缓冲液(pH 7.8)，在 10000rpm 4离心 15分钟。取上清液 1ml加入磷酸缓冲液 0.9ml和 10mM盐酸羟胺0.1ml，在 25混合并培养20分钟。取 1ml培养液依次加入 1ml 17mM对氨基苯磺酸和1ml 7mM a萘胺，在 25反应 20分钟，反应后的显色液用同体积正丁醇充分摇匀，10000rpm离心5分钟后分层 ,取正丁醇相测A530。用磷酸缓冲液代替样品作空白。3.2.4 NADPH活性的测定按Sagi和Fluhr（2001）的方法进行，采用提取纯化的细胞膜囊，通过NADPH氧化酶产生的活性氧氧化XTT的量来表示该酶活性。反应体系1ml包括50mm Tris-HCl 缓冲液(pH7.4) 0.5mm XTT,100m NADPH和15-20 g 蛋白量的细胞膜微膜囊，加入NADPH启动反应，XTT 减少量可通过470 nm检测。本底值（background production）可在反应系统中加入50 units SOD 测得。酶活性可通过XTT比吸收系数2.16104 m 1cm 1换算成活性氧的量来表示。3.2.5过氧化物酶（POD）活性的测定过氧化物酶（POD）活性的测定参照曾韶西（1997）的方法。取金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮1g，加入4ml0.05mol/l的磷酸缓冲液（PH7.8）和0.2g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），冰浴研磨，15000rpm 于4下离心15min，上清液用于酶活性的测定。3ml反应液中包括：0.95ml0.2%愈创木酚，2ml0.1%H2O2，0.5ml粗酶液，迅速比色，测在OD470值在180秒内的变化量， 每分钟变化0.01为一个酶活单位U，酶的活性以Ug-1FW 表示，重复3次。3.2.6 CAT活性的测定参照戴宏芬（1991）的方法，酶液的提取同POD，3ml反应液中包括：1ml 0.2% H2O2(以0.05molL-1的磷酸缓冲液配制),1.95ml双蒸水和50ul粗酶液，在240nm处测定OD240值变化，以OD240每分钟减少0.001表示一个酶活力单位（U）,酶的活性以Ug1FW表示，重复3次。测4分钟。3.2.7丙二醛（MDA）含量的测定参照刘祖琪（1994）的方法,取金鱼草花序顶部以下510cm花茎的表皮1g。加入4ml0.05mol/l的磷酸缓冲液（PH7.8）和0.2g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），冰浴研磨，15000rpm 于4下离心15min，取上清液1ml，转入刻度试管，加3ml0.5%硫代巴比妥酸（TBA）（溶于10%的三氯乙酸）混匀，盖上塞，煮沸15min后快速冷却，用双蒸水补至4ml，再4000 rpm离心15min，以磷酸缓冲液为参比，测定上清液在532nm和600nm处的OD值，以(E532-E600)/155计算MDA的含量，以umol/mg（FW）表示。重复3次。3.3 结果分析3.3.1 活性氧基因的提取与测定1) 获得了与活性氧相关的基因（CAT、APX、NADPH氧化酶）的片段序列和3端序列：所获得的CAT基因片段序列长度为512bp，在NCBI上进行BLAST，结果显示该cDNA片段与已发表的编号为gb|AAX88799.1| catalase Euphorbia characias序列相似性达93%。APX基因片段序列长度为249bp，与已发表的编号为gb|AAX84654.1| ascorbate peroxidase Lycopersicon esculent 序列相似性达90%。NADPH氧化酶基因片段序列长度为473bp，与已发表的编号为emb|CAC84140.1| NADPH oxidase Nicotiana tabacum序列相似性达77%，是目的片段。3端序列长度分别为：CAT1012bp，APX 653bp，NADPH氧化酶720bp。2) 获得了与活性氧相关的基因（CDPK、CAM）的片段序列和3端序列：所获得的CDPK基因片段序列长度为347bp，与已发表的编号为emb|CAC83000.1| calcium-dependent protein kinase 2 Nicotiana benthamiana序列相似性达94%。CAM基因片段序列长度为371bp，与已发表的编号为gb|ABR21756.1| calmodulin Actinidia polygama序列相似性达98%。3端序列长度分别为：CDPK948bp，CAM559bp。3.3.2 SA、SNP药剂处理与H2O2含量的变化SA、SNP药剂处理对H2O2含量影响表明：与对照比较，SA处理金鱼草水平放置后2h内，上下侧H2O2基本上比对照高，可见，SA处理诱导了金鱼草H2O2的产生。水平放置0.5h内，SA处理和对照的金鱼草下侧H2O2含量比上侧高；水平放置0.5h之后，SA处理的金鱼草上侧H2O2含量始终比下侧高，而对照是水平放置1至4h，金鱼草上侧H2O2含量才比下侧高，而6h时，上下侧基本一致。SA处理的金鱼草上下侧H2O2含量在2h和4h达到低峰值，并非常接近。可见，金鱼草经SA处理后，上侧H2O2含量在0.5h后就比下侧高，缓减了上下侧H2O2的浓度剃度，从而抑制向重力性反应。与对照比较，SNP处理金鱼草在水平放置4h内，上下侧H2O2含量都比对照高，可见，SNP处理诱导了金鱼草H2O2的产生。SNP处理金鱼草在水平放置过程中，除了6h下，上下两侧H2O2含量接近外，其他时间点都是上侧比下侧高，而对照是在前2h，下侧含量比上侧高，而24h内基本接近，6h时，上侧比下侧高。可见，SNP处理缓减了上下侧H2O2的浓度剃度，从而抑制向重力性反应。3.3.2 SA处理对CDPK和CAT基因表达情况与对照比较，SA处理金鱼草在水平放置2h内，上下侧CDPK表达都比未放置时表达强； 4h内，CDPK基因是上侧比下侧表达强，而对照是2h内，下侧比上侧表达强，46h内才是上侧比下侧表达强，而且随着时间水平放置时间的延长，表达逐渐减弱。而可见，SA处理诱导了金鱼草CDPK的表达，尤其是诱导了上侧CDPK基因表达。CK0 SA0 CK0.5(上) CK0.5(下) SA0.5(上) SA0.5(下) CK1(上) CK1(下) SA1(上) SA 1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SA0 SA2(上) SA2(下) CK4(上) CK4(下) SA4(上) SA4(下) CK6(上) CK6(下) SA6(上) SA6(下) 图1 SA处理金鱼草CDPK基因表达的变化图2 SA处理金鱼草CDPK基因表达的量化变化与对照比较，SA处理金鱼草在水平放置时上下侧CAT表达逐渐增强，达到最强，而且2h时上侧表达比下侧的强，而后随着处理时间延长而逐渐减弱；而对照是1h内，CAT基因表达较强，而且是下侧比上侧表达强。可见，SA处理诱导了金鱼草CAT的表达，尤其是诱导了上侧CAT基因表达。CK0 SA0 CK0.5(上) CK0.5(下) SA0.5(上) SA0.5(下) CK1(上) CK1(下) SA1(上) SA 1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SA0 SA2(上) SA2(下) CK4(上) CK4(下) SA4(上) SA4(下) CK6(上) CK6(下) SA6(上) SA6(下) 图3 SA处理金鱼草CAT基因表达的变化3.3.2 SNP处理对CDPK和CAT基因表达情况与对照比较，SNP处理金鱼草在水平放置时上下侧CDPK表达达到最强，而且2h时下侧表达比上侧的强，而后随着处理时间延长而逐渐减弱；而对照是0.5h内，CDPK基因表达较强，也是下侧比上侧表达强，而后随着处理时间延长表达逐渐减弱。可见，SNP处理延缓了金鱼草CDPK的表达。CK0 SNP0 CK0.5(上) CK0.5(下) SNP0.5(上) SNP0.5(下) CK1(上) CK1(下) SNP1(上) SNP1(下) CK2(上) CK2(下) CK0 SNP0 SNP2(上) SNP2(下) CK4(上) CK4(下) SNP4(上)SNP4(下) CK6(上) CK6(下) SNP6(上) SNP6(下) 图4 SNP处理金鱼草CDPK基因表达的变化图5 SNP处理金鱼草CDPK基因表达的量化变化与对照比较，SNP处理金鱼草在水平放置时上下侧CAT表达都比对照强；在2h内，CAT基因表达逐渐增强达到最强，此时，上侧比下侧表达强，而后随着处理时间延长表达逐渐减弱。对照是0