cDNA第二链合成.doc

1. Superscipt IIRT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul Xho I Primer(1.4ug/ul) (5 GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3) 11-x ul RNase-free water（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）2. 混匀后,70反应10分钟;3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:4ul 5first strand buffer2ul 0.1M DTT1ul 10mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后,42放置2分钟;6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt IIRT,混匀;7. 42反应50分钟,然后70,15分钟灭活反转录酶.2. cDNA第二链的合成:1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物20冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16反应2.5小时;3. 70灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。3.双链cDNA末端补平:1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37反应至少30分钟,然后75灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1溶液PE使用前应加入适量体积95100的乙醇，混匀。2向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。3加入spin column中，13000rpm离心1min。4加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。513000rpm，再离心1min。6将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。713000rpm离心2min。8加入30ul buffer EB，静置10min。913000rpm离心2min。10加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，20沉淀过夜。4 EcoR I adaptor加接:1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂: 1.2ul 10Ligase Buffer1ul 10mM rATP1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)3. 混匀后,4连接3days,或者8过夜连接;5双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切:1. 连接反应完成后,将反应体系70放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul 10Ligase Buffer1ul 10mM rATP6ul dd H2O1ul T4 PNK(10U/ul)3. 37反应30分钟,然后70灭活15分钟;4. 稍微离心使反应物集中至管底;5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:4ul Xho 10Buffer2ul BSA5ul ddH2O8ul Xho I (10U/ul)6. 37反应1.5小时,然后65灭活酶10分钟;7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4准备回收。6.胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit回收试剂盒)1配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶2取4保存样品上样，40ul/孔。3电泳50V；1hr4紫外灯下分别切下5001kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。5称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）650 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII750 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮84，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）9加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬10 离心并去上清（同操作8）11 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清12 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清13 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。14