脂肪酶的分离纯化.doc

贺州学院课程考核试卷（论文）（20132014学年第 1 学期）课程名称：酶工程 开课单位：化生学院 考核年级、专业：11生物工程 任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法离子交换层析和疏水层析法，对Candida sp. 99125 脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200 U/mg，回收率为35.5%. SDSPAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40，最适反应pH 值为8.5，在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.1 前言脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH 和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂1.在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质2和手性化合物的拆分反应3.Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油4、维生素A 酯5、棕榈酸异辛酯6等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此，本研究采用简单的两步法离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candidasp. 99-125 脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2 材料与方法2.1 试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candida sp. 99125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪；DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.2.2 实验方法2.2.1 粗酶液的制备 取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.2.2.2 离子交换层析法纯化脂肪酶以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用00.4 mol/L的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15 倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3 疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中加入固体硫酸铵至0.8 mol/L，将该溶液注入经0.8 mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中. 先用0.8mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.80.0 mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10 倍柱体积，最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析.2.2.4 脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法7.酶活定义：脂肪酶在40, pH 为8.0 的条件下水解橄榄油乳化液产生1 mol/min 脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位(记为1 U).2.2.5 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法8. 标准蛋白质为1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA).2.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3 节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2 倍SDSPAGE 上样缓冲液，经沸水浴加热35 min，得到电泳样品. 电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150 V. 电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3 结果与讨论3.1 脂肪酶的纯化3.1.1 离子交换层析采用DEAE Sepharose FF (1 mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被DEAE 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质. 然后用NaCl 溶液梯度洗脱，结果如图1 所示. 图1 层析柱DEAE 分离纯化脂肪酶图1 显示有2 个蛋白吸收峰(A, B)，A 峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A 峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B 峰为杂蛋白峰. 活性测定表明，A 峰的比活为16600 U/mg，纯化倍数为6.1 倍，酶收率为55.7%.但2 峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candida sp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2 疏水层析采用Phenyl Sepharose FF (1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被Phenyl 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，表明没有酶活性物质被洗脱出来. 用硫酸铵溶液梯度洗脱酶液的实验结果见图2.图2 表明，以梯度为0.80.0 mol/L 的硫酸铵溶液洗脱时，脂肪酶蛋白并没有被洗脱下来，说明脂肪酶蛋白的疏水性比较强，与Phenyl 柱结合牢固；而以20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱时，洗脱液则表现出较高的脂肪酶活性. 脂肪酶经Phenyl Sepharose FF 层析柱进一步纯化后，收率为63.7%，纯化倍数为1.6 倍. 图2 层析柱Phenyl 分离纯化脂肪酶综上所述，Candida sp. 99-125 脂肪酶在经过DEAE离子交换层析和Phenyl 疏水层析两步纯化后，其比活为27200 U/mg，比粗酶提高了10.0 倍，产品收率为35.5%.3.2 脂肪酶的性质3.2.1 脂肪酶的最适反应温度分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同温度下的酶活性，结果见图4，表明该脂肪酶的最适反应温度为40.3.2.2 脂肪酶的最适反应pH 值在37下，分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同pH 下的酶活性，结果见图5，表明该脂肪酶的最适反应pH 值为8.5.3.2.3 脂肪酶的温度稳定性 将纯化后的酶液在不同温度下放置1 h 后测定酶活性，结果见图6. 该脂肪酶在高于35的条件下容易失活，但在室温(2030)下放置时具有较好的稳定性. 将酶在室温(20)下放置2d，其酶活收率在95%以上.3.2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入5 mmol/L 的MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2 溶液和2.5 mmol/L 的K2SO4 溶液，在30下放置30 min，以不加离子的酶液为对照，分别测定其酶活.图7 表明，Fe2+和Cu2+对此酶有明显的抑制作用；而Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%. 这说明适量的Ca2+能够促进脂肪酶活性的提高，对酶分子的最佳活力构象起稳定作用. 因此，可选择CaCl2 作为活化剂以提高酶活性.3.2.5 表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入1 mmol/L 的EDTA, -Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT)和SDS,以及0.1%的Triton-X100, Tween80, Span60 和Span85，在30下放置30 min 后测定酶活，以不加表面活性剂或抑制剂的酶液为对照，结果见图8. 可见加入0.1%的Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而1 mmol/L 的SDS 的引入对酶有抑制作用，EDTA 对酶活性的影响不大，说明该酶不是金属结合酶. 其他表面活性剂和抑制剂对酶活性的影响不大.3.3 假丝酵母系脂肪酶性质的比较 Candida antarctica 脂肪酶B 的催化活性强，比活约为9 U/mg (Fluka 公司商品酶，62288 lipase B, Candidaantarctica，recombinant from Aspergillus oryzae)，温度稳定性好，立体选择性高9，特别是商品固定化产品Novozyme 435 在6080下仍保持较高的催化活性10.Candida rugosa 脂肪酶包含5 个同工酶11，不同的同工酶对不同碳链脂肪酸的选择性差别较大，纯化的LipA 比活为750 U/mg12，最适反应温度在3540，最适反应pH 值为7811.Candida lipolytica 脂肪酶报道较多，姜延程等13对该酶采用DEAECellulose DE-52 和DEAESephadexA-50 离子交换层析等步骤纯化，比活提高27.4 倍，达到169 U/mg，收率11%；徐岩等1采用盐析和透析的方法将比活提高2.69 倍，收率45%；张金红等14采用疏水层析法对其进行分离纯化，比活提高了10 倍以上. 但该酶的温度稳定性差，在30下存放24 h，酶活损失50%以上13. 4. 结 论通过Candida sp. 99-125 脂肪酶的分离纯化及其酶学性质研究，得到如下结论：采用DEAE Sepharose FF 离子交换层析和PhenylSepharose FF (Low sub)疏水层析两步进行纯化，使Candida sp. 99-125 脂肪酶的比活显著提高，达到27200U/mg，为粗酶的10.0 倍，收率为35.5%. 经分析该酶的分子量约为38 kDa.(2) Candida sp. 99125 脂肪酶纯化后的最适反应温度为40，最适反应pH 为8.5. 该脂肪酶在室温(20)条件下具有较好的稳定性，放置2 d，其酶活保留达95%以上. Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而Fe2+, Cu2+和SDS 对其有明显的抑制作用.参考文献：1 徐岩, 李建波, 王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究 J.无锡轻工大学学报, 2001, 20(3): 257260.2 Bourg-Garros S, Razafindramboa N, Pavia A A. Large-scalePreparation of 3-Hexen-1-yl Acetate Using Candida antarcticaImmobilized Lipase in Hexane J. Biotechnol. Bioeng., 1998, 59(4):498500.3 Maria S C, Jose V S G. Lipase-catalyzed Synthesis of Chiral Amides:A Systematic Study of the Variables that Control the Synthesis J.Tetrahedron, 1998, 54: 28772892.4 Deng L, Nie K L, Wang F, et al. Studies on Production of Biodiesel byEsterification of Fatty Acids by a Lipase Preparation from Candida sp.99-125 J. Chin. J. Chem. Eng., 2005, 13(4): 529534.5 Yin C H, Liu T, Tan T W. Synthesis of Vitamin A Esters byImmobilized Candida sp. Lipase in Organic Media J. Chin. J. Chem.Eng., 2006, 14(1): 8186.6 陈必强，叶华，谭天伟. 固定化假丝酵母脂肪酶合成棕榈酸异辛酯 J. 化工学报, 2004, 55(3): 422425.7 何耀强，王炳武，谭天伟. 假丝酵母99-125 脂肪酶的发酵工艺研究 J. 生物工程学报, 2004, 20(6): 918921.8 汪家政，范明. 蛋白质技术手册 M. 北京：科学出版社, 2000.4246.9 赵天涛，高静，李伟杰. 南极假丝酵母脂肪酶B 的催化机理及应用前景 J. 分子催化, 2005, 19(2): 155160.10 Borg P, Binet C, Girardin M, et al. Enzymatic Synthesis of Trieicosapentaenoylglycerol in a Solvent-free Medium J. J. Mol.Catal. B: Enzymatic, 2001, 11: 835840.11 Vakhlu J, Kour A. Yeast Lipases: Enzyme Purification, BiochemicalProperties and Gene Cloning J. Electro. J. Biotechnol., 2006, 9(1):6985.12 Rua M L, Fernandez V M,