三氯乙烯药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究毕业论文.doc

三氯乙烯药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究三氯乙烯药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究 毕业论文毕业论文 目目 录录 中文摘要中文摘要 1 英文摘要英文摘要 6 英文缩写词表英文缩写词表 12 前前 言言 14 第一部分第一部分 TCE 药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究 19 第一节 TCE 药疹样皮炎患者外周血淋巴细胞抗原特异性增殖功能测 定 21 第二节 TCE 药疹样皮炎患者外周血免疫细胞检测分析 26 第三节 Fas FasL 与 PF GrB 介导的 TCE 免疫毒作用机制探讨 37 小 结 55 第二部分第二部分 8 例例 TCE 药疹样皮炎患者病例报告分析药疹样皮炎患者病例报告分析 56 小 结 71 总总 结结 72 致致 谢谢 74 参考文献参考文献 76 附录附录 1 生物标志物的验证及其在健康危险预警中的作用生物标志物的验证及其在健康危险预警中的作用 86 附录附录 2 个人简历个人简历 96 1 前前 言言 三氯乙烯背景资料 三氯乙烯背景资料 1 理化性质 三氯乙烯 Trichloroethylene TCE 是由碳 氢 氧三种元素组成的无色 透明 不燃烧 易挥发具有芳香味的液体 分子式 C2 H Cl3 分子量 131 39 相对密度 1 4649g cm3 20 4 熔点 73 沸点 86 7 闪点 32 22 闭杯 自燃点 420 蒸气密度 4 53 蒸气压 13 33kPa 100mmHg32 蒸气 与空气形成混合物可燃限 8 0 10 5 几乎不溶于水 与乙醇 乙醚及氯仿 混溶 溶于多种固定油和挥发性油 潮湿时遇光生成盐酸 高浓度蒸气在高温 下会燃烧 加热分解 放出有毒氯化物 加热至 250 600 与铁 铜 锌 铝 接触生成光气 能与钡 四氧化二氮 锂 镁 液态氧 臭氧 氢氧化钾 硝 酸钾 钠 氢氧化钠 钛发生剧烈反应 2 主要用途 自 19 世纪初期 TCE 的在工业上应用广泛 可用作金属脱脂和羊毛及织 物的干洗剂 1 树脂 沥青 煤焦油 醋酸纤维素 硝化纤维素 橡胶和涂料 等的溶剂 在医药上用作麻醉剂 农药上是合成一氯醋酸的原料 由于其挥发 性和溶解能力极强 并且通常条件下不燃 沸点适中 蒸汽压力高 稳定性强 适合于气洗操作 在工业上广泛用于金属清洗 脱脂彻底 和纤维脱除油脂 1 利用其溶解力强的特性 常用于清除难于清除的污垢 如半硬化的清漆 涂层 剖光剂 较厚的助焊剂 也用于萃取剂 溶剂和低温导热油介质 作为原料中 间体可用于生产四氯乙烯 氯乙酸 二氯乙酰氯 八氯二丙醚 HCFC 123 HCFC 124 HFC 125 HFC 134a 等 但其主要的应用领域是作为清 洗剂使用 目前我国已经成为全球电子电气产品主要生产国 2004 年清洗剂领 域消耗 TCE 约 4 9 万吨 据海关统计 2004 年广东地区进口 1 万余吨的三氯乙 烯的 90 是用于电子原件的清洗 2 2 3 健康危害 TCE 有刺激和麻醉作用 吸入急性中毒者有上呼吸道刺激症状 流泪 流 涎 随之出现头晕 头痛 恶心 运动失调及酒醉样症状 当出现头晕 头痛 倦睡 恶心 呕吐 腹痛 视力模糊 四肢麻木 甚至出现兴奋不安 抽搐乃 至昏迷 可致死 慢性影响 有乏力 眩晕 恶心 酩酊感等 可有肝损害 皮肤反复接触 可致皮炎和湿疹 对中枢神经系统有抑制作用亦可累及周围神 经系统和心 肝 肾等实质脏器 能提高交感神经的反应性 并使其递质生成 增加 从而使心脏对刺激的敏感性增高 职业性 TCE 中毒 是工作中接触高浓 度 TCE 蒸汽或液体所引起的以神经系统改变为主的全身性疾病 除神经系统外 心 肝 肾亦可累及 近年来 我国关于 TCE 的健康危害 主要集中在职业人 群中的 TCE 引起的药疹样皮炎 该病以全身的皮肤损害为主要表现 同时伴有 发热 浅表淋巴结肿大 皮肤红肿糜烂等症状 病情严重者可因心 肝 肾功 能衰竭和 或合并细菌感染而死亡 4 代谢 TCE的吸收和排出随其脂溶度 水溶度 空气中浓度和机体通气量等因素 而定 可经呼吸道 消化道和皮肤吸收 吸收后主要蓄积于肝脏 脑和心脏等 器官 3 其中10 20 未经代谢的TCE可以原形自呼吸道中排出 也可以在体 内代谢后经尿排出 随尿排出的两种主要代谢物三氯乙醇 TCOH 及三氯乙 酸 TCA 约占TCE吸收量的80 90 TCE大部分在24h内排出 TCA排出 较慢 一次接触后 大部分2 3 d后排除 每日接触则持续上升 可达第一天 的7 12倍 至周末达最高浓度 一般认为TCE在体内的代谢有两条通路 一条是CYP450 Cytochtome P450 介导的氧化代谢通路 一条是谷胱甘肽 glutathione GSH 依赖的结合代谢通路 在这两条通路中共有9种代谢酶参与 可生成12种代谢产物 4 在氧化代谢通路 中 TCE首先经CYP450代谢主要生成二氯乙酸 乙二酸 N 羟乙酰基氨基乙醇 和三氯乙醛 三氯乙醛可自发转化为水合氯醛 水合氯醛可经醛脱氢酶 ALDH 作用氧化为三氯乙酸 也可经醇脱氢酶 ADH 作用生成三氯乙醇 后者在UDP 葡糖醛酸转移酶 UDPGT 催化下形成葡糖醛酸结合产物 经肾脏排出体外 三 氯乙醇和三氯乙酸还可以脱氯形成二氯乙酸 氯乙酸和乙二酸 这几种代谢产 3 物生物半减期较短 在GSH依赖的结合代谢通路中 TCE经谷胱甘肽转移酶 glutathione S transferase GSTs 催化形成S 1 2二氯乙烯基谷胱甘肽 S 1 2 dichlorovinyl glutathione DCVG 然后在谷氨酰胺转移酶 GGT 和二肽酶催化下转化为S 1 2二氯乙烯基半胱氨酸 S 1 2 dichlorovinyl L cysteine DCVC DCVC的进一步代谢存在两条分支 一条是经 裂合酶作用生 成巯基烯酮类活性中间代谢产物 是发挥毒性作用的主要物质 另一个分支是 经N 乙酰转移酶 N acetyltranferase NATs 催化转化为无毒的硫醇尿酸排出体 外 5 中毒机理 TCE 属蓄积性麻醉剂 其麻醉作用仅次于氯仿 对中枢神经系统有强烈的 抑制作用 亦可累及周围神经系统和心 肝 肾等实质脏器 能提高交感神经 反应性 并使其递质生成增加 从而使心脏对刺激的敏感性增高 给予肾上腺 素可引起心室颤动 6 刺激性 液态 TCE 对皮肤有刺激作用 TCE 蒸气对呼吸道及眼睛有刺激性 家兔经 眼 20 mg 24 h 中度刺激 家兔经皮 500 mg 24 h 重度刺激 7 致癌性 国际癌症研究署 IARC 致癌性评论 动物阳性 人类不明确 1995 年 划为人类可能致癌物 肝癌和淋巴癌 亦即 2A 类致癌物 8 致突变性 DNA 抑制 人淋巴细胞 5 mg L 姊妹染色单体交换 人淋巴细胞 178 mg L 9 遗传毒性 黄海雄等 5 用精子畸形试验设置三个剂量组 TCE分别为1706 853和 427mg kg体重 和一个溶剂对照组 花生油 一个阳性对照组 环磷酰胺 40mg kg体重 经口灌胃给予受试物 连续5天 于首次给予受试物后的第35天 处死动物 制片 观察精子形态 并与阳性对照组和阴性对照组进行比较分析 结果发现各剂量组与阴性对照组相比 低剂量组的精子畸形率差异无显著性 P 0 05 中 高剂量组的精子畸形率差异有非常显著性 P 0 01 提示TCE可 4 能对雄性生殖细胞有遗传毒性 10 环境危害 该物质对环境有严重危害 应特别注意对空气 水环境及水源的污染 在 对人类重要食物链中 特别是在水生生物体中发生生物蓄积 根据 TCE 的理化性质 国内外研究的结果以及现场劳动卫生学和职业流行 病学调查的资料 并参考其它国家的职业接触限制及其制定依据 我国卫生部 于 2002 年 4 月 8 日发布了 工作场所有害因素职业接触限值 GBZ2 2002 其中规定工作场所空气中 TCE 时间加权平均容许浓度 TWA 为 30mg m3 短 时接触平均容许浓度 STEL 为 60mg m3 以工作周末的班末尿三氯乙酸浓度 0 3mmol L 50mg L 作为接触 TCE 工人群体的生物限值 Biological exposure index BEI 6 三氯乙烯药疹样皮炎的发病状况 三氯乙烯药疹样皮炎的发病状况 近年来 国内外均有关于 TCE 引起药疹性皮炎的报道 我国自 1988 年首 次报道职业接触 TCE 工人引起的药疹样皮炎以来 根据文献报道至今累计报告 已经超过 300 例 并有多起死亡病例的发生 在国外 自 1947 年 Schwartz 首 次报道至今 只有 20 例类似的病例报道 美国 新加坡 日本和西班牙等 7 因此对该病的研究主要来自于我国 TCE药疹样皮炎在临床上一般表现为先有发热 随后出现皮疹 伴浅表淋 巴结肿大和严重肝损害 部分还可伴有肾损害 皮疹呈剥脱性皮炎 多形红斑 重症多形红斑或大疱性表皮坏死松解症 来势凶猛 病情严重 其发病特点 有明确TCE接触史 但剂量 效应关系不明显 一般于接触本品2 4周发 病 也有短至6天者 呈散发性 同车间仅有1 2人发病 病例再接触可再 发病 部分患者作皮肤斑贴试验 显示对本品和 或三氯乙醇 三氯乙酸呈阳 性反应 激素治疗效果良好 8 根据该病的发病特点 一般认为其可能是由于TCE引起的 型变态反应性 疾病 同时 该病的发生具有明显的个体遗传易感性差异 易感者在短期接触 2 4周 即可发病 而接触时间超过3个月未发病者则一般不再发病 过敏性 疾病的发生主要是由于基因因素和环境因素间的相互作用 9 目前对该病研究 5 较多的是代谢酶基因多态性以及免疫相关基因多态性 具有慢代谢NAT2基因型 个体发生药疹样皮炎的危险性大于具有快代谢基因型个体 OR 3 49 95 CI 1 29 9 46 10 本实验室在前期的研究中发现HLA B 1301携带者对TCE致过敏性皮炎有很高的易感性 OR 27 5 P 1 48 10 21 而HLA B 1301为东方黄种人特异性等位基因 11 此可以解释TCE药疹样皮炎在 黄种人中高发的原因 尽管如此 对于该病的发病机制尚不清楚 由于 TCE 皮炎的临床表现包括 全身性皮肤炎症并伴有多器官和组织损害 发病机制较复杂 体内何种免疫细 胞参与这种过敏反应 是否有细胞因子分泌紊乱尚不清楚 最终的致敏性代谢 产物不清楚 这些均为限制研发有效的预防和治疗措施的未知因素 目前尚无 可以反映严重危害的早期生物检测指标 临床上尚缺乏特异性治疗措施以及反 映疾病转归的特异性指标 由于工艺上的原因 近期内尚不能完全替代和禁止 TCE 的使用 有学者认为 TCE 作为清洗剂在国内的市场需求将稳步增长 预计 2010 年清洗剂领域月消耗 TCE 6 0 万吨 12 并且职业接触工人的流动性很大 导致新接触 TCE 的人群居高不下 通过降低工作场所的接触浓度也不能有效预 防该病的发生 因此 该病的发病率并不能得到有效的控制 本研究针对 TCE 药疹样皮炎目前存在的问题 根据 T 细胞介导的细胞免疫 发生的机制 拟通过包括 TCE 药疹样皮炎病例组 健康的 TCE 接触工人对照 组以及非 TCE 接触对照组的成组设计分析以及病例入院和皮疹消退肝功能恢复 时机体免疫指标的比较分析 探索 TCE 药疹样皮炎患者及健康的 TCE 接触工 人体内细胞免疫学指标的变化 为该病的临床筛检和治疗提供理论依据 并为 进一步对该病的免疫学机制研究提供线索 6 第一部分第一部分 TCE 药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究药疹样皮炎细胞免疫学指标及发病机制研究 TCE 药疹样皮炎是由 TCE 和 或其代谢产物引起的免疫系统异常反应的疾 病 其发生可能受多种因素的影响 在职业环境中 其浓度低于国家接触限值 时仍可发病 因此很难通过控制作业场所中 TCE 的浓度而减少该病的发生 以 往对 TCE 药疹样皮炎病例的临床检查发现 病例血液中嗜酸性粒细胞明显增多 13 14 越飞 15 等对 TCE 药疹样皮炎的病例淋巴细胞增殖试验结果显示 病例组 外周血淋巴细胞转化率明显升高 且病例组 CD4 CD8 T 细胞的比值较正常人 升高 但无显著差异 这些结果提示 TCE 药疹样皮炎可能是细胞免疫介导的接 触性过敏性皮炎 allergic contact dermatitis ACD 目前关于该病也缺乏临床 上特异性的筛检指标和治疗措施 常常是以发病工人脱离 TCE 接触和对症治疗 为主 因此 从 T 细胞介导的细胞免疫过程入手 探索针对 TCE 药疹样皮炎的 早期筛检指标 为该病的检测 诊断以及评价临床治疗效果具有重要意义 本部分选择三组研究对象开展研究 并按年龄 性别进行匹配 病例组 选择深圳市职业病防治院收治的处于 TCE 药疹样皮炎早期的患者 16 例 所有 病例均严格按照 职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准 GBZ 185 2006 诊 断 患者在发病前均在中国深圳市电子厂或五金制品厂直接从事金属部件的清 洗工作或者患者工作车间里含有清洗工作岗位 清洗液的主要成分为 TCE 直 接从事清洗工作的工人接触 TCE 的方式有皮肤和呼吸道接触 非清洗工人主要 以呼吸道吸入方式接触 TCE 在发病前一个月所有的病例均无服用任何药物 排除由药物引起的过敏反应 接触对照组 选择与 TCE 药疹样皮炎病例相同工 厂相同车间相同工种但未发生 TCE 药疹样皮炎的健康职业工人 32 例 32 例接 触对照工人随访期均超过 TCE 药疹样皮炎的潜伏期 90 天 非接触对照组 7 选择健康的从未接触过 TCE 以及其他职业有害因素的健康就业前体检工人 28 例 经知情同意 使用调查表收集所有研究对象个体人口学资料 职业暴露史 个体既往健康 疾病史 所有研究对象均排除肝病史 免疫系统疾病史 包括 糖尿病 哮喘 过敏性皮炎 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎以及遗传性过 敏性疾病史等 见表 1 1 表 1 1 研究对象基本特征 非接触对照组接触对照组病例组 例数 个 283216 男 个 女 个 16 1220 1210 6 年龄 岁 中位数232220 5 最小值 最大值 17 43 18 40 18 45 接触时间 天 中位数015030 5 最小值 最大值 6 1125 15 62 8 第一节第一节 TCE 药疹样皮炎患者外周血淋巴细胞抗原特异性增殖药疹样皮炎患者外周血淋巴细胞抗原特异性增殖 功能测定功能测定 目前普遍认为 TCE 引起的药疹样皮炎是由 TCE 诱导机体细胞免疫系统参 与的接触性过敏反应性疾病 细胞免疫反应发生的过程包括两个阶段 诱导阶 段和激发阶段 诱导阶段是在外源化学物 抗原 的刺激下 机体发生抗原特 异性淋巴细胞的活化 这些活化的淋巴细胞再次接触到相同的抗原时 会发生 增殖反应 激发阶段则以接触部位皮肤出现病理组织学改变为终点 本节对 TCE 药疹样皮炎病人外周血淋巴细胞进行体外培养 同时在培养液中加入不同 浓度的 TCE 作为抗原进行刺激 观察淋巴细胞是否出现抗原特异性增殖反应 评价 TCE 药疹样皮炎病人是否发生针对 TCE 本身的抗原特异性免疫应答 此 将有助于了解 TCE 对外周血淋巴细胞的细胞毒性和特异性增殖作用 并探讨 TCE 药疹样皮炎的发生机制 1 材料与方法材料与方法 1 1 主要仪器 KST340型水平离心机 sigma公司 CO2培养箱 美国SHEL LAB公司 550型酶标仪 Bio Rad公司 U型底细胞培养板为Costar公司 1 2 主要试剂 胎牛血清 FCS 杭州四季青生物工程有限公司 RPMI1640培养液 HyClone公司 TCE 99 5 分析纯级 二甲基亚砜 DMSO 噻唑 兰 thiazolyl blue MTT Sigma公司 青链霉素 上海生物工程有限公司 淋巴细胞分离液 中国医学科学院生物工程研究所 1 3 研究对象 在全部研究对象中 外周血淋巴细胞抗原特异性增殖实验获得成功结果的 有病例组工人 11 例 其中男 7 例 女 4 例 年龄 18 29 岁 平均 23 岁 中位 9 数 接触对照组 19 例 其中男 13 例 女 4 例 年龄为 19 30 岁 平均 22 岁 非接触对照组 15 例 其中男 9 例 女 6 例 年龄为 19 27 岁 平均 22 岁 中 位数 所有研究对象在晨起空腹条件下 采集肘静脉肝素抗凝血 8ml 于 4 小时内进行实验室检测 1 4 主要试剂的配制 1 4 1 淋巴细胞培养液 RPMI1640 培养液 89ml 加入胎牛血清 10ml 青链霉 素 1ml 1 4 2 5 TCE 在 1ml 离心管中先加入 95 l DMSO 再加入 5 l TCE 吹打几 次 充分混匀 200 l 细胞悬液中加入 1 8 l 5 TCE 终浓度即是 5mmol L 1 4 3 1 TCE 在 1ml 离心管中先加入 80 l DMSO 再加入 20 l 5 TCE 吹 打几次 充分混匀 200 l 细胞悬液中加入 1 8 l 1 TCE 终浓度即是 1mmol L 1 4 4 0 2 TCE 在 1ml 离心管中先加入 80 l DMSO 再加入 20 l 1 TCE 吹 打几次 充分混匀 200 l 细胞悬液中加入 1 8 l 0 2 TCE 终浓度即是 0 2mmol L 1 4 5 MTT 溶液 取 50mg MTT 粉末 在 15ml 无菌管中加入 10ml 无菌三蒸水 溶解 配制成 5mg ml 浓度的应用液 1 5 血液的处理 淋巴细胞增殖功能的测定 采用 MTT 法 16 程序如下 首先用淋巴细胞分离液分离研究对象外周血淋巴细胞 用含 10 FCS 的 RPMI1640 培养液将细胞浓度调整为 2 106个 ml 分别加入 96 孔细胞培养板中 每份细胞悬液分为 DMSO 孔 0 2mmol L 1 mmol L 5 mmol L 并分别设置 3 个平行孔 各孔加入细胞悬液 每孔 0 2ml DMSO 孔为溶剂对照孔 加入 1 8 微升 DMSO 0 2mmol L 1 mmol L 5 mmol L 孔分别加入相应浓度用 DMSO 溶解的 TCE 置于 5 CO2 37 培养箱中培养 72 小时 培养结束前 4 小时每孔加入 10 l MTT 5mg ml 混匀 继续培养 4 小时 培养结束后 1000r min 离心 5min 轻轻吸弃上清 每孔加入 0 2ml DMSO 吹打混匀 使紫 色结晶完全溶解 用酶标仪以 490nm 波长测定吸光度值 A490nm 并按照下 面公式计算出不同 TCE 染毒浓度下淋巴细胞的相对存活率 10 TCE 孔 A490nm 淋巴细胞相对存活率 DMSO 孔 A490nm 100 1 6 统计学处理 由于资料不符合正态和方差齐性 因此采用非参数法 用 SPSS11 5 统计软 件 三组间比较采用成组设计的多个独立样本比较的秩和检验 Kruskal Wallis 法 两组间比较用两独立样本的秩和检验 Mann Whitney 法 所有统计 学检验均为双侧 显著水平设为 0 05 分析结果用中位数 最小值 最大值 表示 2 结果结果 2 1 研究对象外周血淋巴细胞相对存活率 三组研究对象淋巴细胞相对存活率均随着 TCE 浓度的增加而呈下降趋势 组间差异均有统计学意义 p0 05 见表 1 1 1 表 1 1 1 三组研究对象不同 TCE 浓度染毒情况下淋巴细胞存活率 DMSO 细胞存活率 0 2 TCE 细胞存活率 1 TCE 细胞存活率 5 TCE 细胞存活率 病例组100 98 10 84 70 110 12 91 09 59 33 105 78 63 55 33 50 97 66 接触对照组100 98 64 70 40 117 53 90 59 53 88 102 82 58 96 41 03 87 48 非接触对照组100 95 37 89 82 106 36 88 19 74 82 98 91 67 22 44 84 85 42 注 表示与 0 2 TCE 比较 P 0 05 表示与 1 TCE 比较 P0 05 提示经 TCE 处理后的病例组和接触对照组外周血淋巴细胞无明显的增殖变化 因此未检测 到病例组和接触对照组体内存在针对 TCE 的特异性致敏淋巴细胞 推测产生以 上结果的原因有以下几点 第一 TCE 需要在体内经过代谢活化后才能形成半 抗原 药疹样皮炎的发生主要是由 TCE 的代谢产物而非 TCE 本身所引起 在 体内并不存在针对 TCE 原形的抗原特异性致敏淋巴细胞 在体外 人外周血淋 巴细胞对 TCE 的代谢能力较弱 产生的活性代谢产物的量不足以引起该类淋巴 细胞的增殖 动物试验的研究结果表明 17 TCE 致敏豚鼠脾淋巴细胞与 TCE S9 共培养后的淋巴细胞存活率高于 TCE S9 而正常对照组豚鼠脾淋 巴细胞与 TCE S9 共培养后的存活率低于 TCE S9 提示 TCE 经 S9 代谢活 化后其活性代谢产物才对致敏动物的淋巴细胞产生促增殖活性 第二 TCE 在 体内主要在肝脏内进行代谢 可能与体外淋巴细胞对 TCE 的代谢机制不同 所 产生的代谢产物不同 在体外 TCE 不能通过人外周血淋巴细胞代谢为具有致 敏性的代谢产物 第三 TCE 或其代谢产物作为小分子化学物 分子量 1000 通常认为其是作为半抗原与体内的某些蛋白分子结合形成全抗原后才能发挥其 免疫学效应 而在体外 缺乏这种与 TCE 和 其代谢产物发生特异性结合的蛋 白 而使得 TCE 不能发挥其免疫学功能 第四 体外 TCE 对细胞的毒性作用 远远大于其对致敏淋巴细胞的增殖作用 而掩盖了 TCE 对淋巴细胞的增殖作用 使仅仅检测到了细胞毒作用 陈海燕等 18 用 SD 大鼠建立 TCE 致敏动物模型 并采集心脏血分离单个核 细胞 进行淋巴细胞增殖试验 结果表明 TCE 单独作用可体外刺激致敏大鼠 的单个核淋巴细胞的增殖 另外一项在小鼠中的研究结果发现 TCE 致敏的小 12 鼠脾淋巴细胞与 TCE 体外共培养 72 小时后 细胞存活率与溶剂对照组相比显 著升高 致敏的小鼠脾淋巴细胞在体外再次接触到半抗原 TCE 后 发生半 抗原特异性增殖 19 以上两项研究与本次研究结果的不一致性推测是由于采用 了不同种属的动物外周血淋巴细胞对 TCE 的代谢能力不同导致 由此可见 TCE 免疫毒效应必须结合 TCE 代谢途径和个体易感性进行综合 分析 其免疫毒效应是由 TCE 本身还是由其代谢产物发挥主要作用 以及是否 多种代谢产物的联合作用 还需进一步研究 尤其是淋巴细胞抗原特异性增殖 试验 需要直接使用 TCE 的多种代谢产物进行细胞培养加以鉴定 13 第二节第二节 TCE 药疹样皮炎患者外周血免疫细胞检测分析药疹样皮炎患者外周血免疫细胞检测分析 随着流式细胞术的广泛应用 淋巴细胞亚群检测常被用来作为评价机体免 疫功能状态的重要指标 如T淋巴细胞 CD3 辅助性淋巴细胞 CD4 和 细胞毒性淋巴细胞 抑制性T细胞 CD8 20 该技术常用于辅助临床疾病的诊 断 探索疾病的发病机理 并指导临床治疗方案 本研究通过血常规以及流式 细胞术对TCE药疹样皮炎患者及健康的TCE接触工人外周血各群免疫细胞进行 检测分析 探索可用于疾病早期筛检的指标以及TCE对接触工人的免疫学效应 指标 1 材料与方法材料与方法 1 1 主要仪器 KST340型水平离心机 sigma公司 EPICS ALTRA流式细胞仪 美国 Backman Coulter公司 Sysemx XT 1800I 日本东亚公司 1 2 主要试剂 胎牛血清 FBS 杭州四季青生物工程有限公司 多聚甲醛 分析纯 天津市福晨化学试剂厂 抗体 Anti human CD3 PE CY5 Anti human CD8 PE Anti human CD4 FITC Anti human CD19 FITC Anti human CD56 PE Anti human CD28 FITC及溶血素 10 BD Pharmingen公司 1 3 研究对象 本节对全部研究对象进行了检测 1 4 血生化检测 不抗凝血分离血清后采用日本岛津 CL 8000 全自动生化分析仪 测定血清 中丙氨酸氨基转移酶 ALT 天门冬氨酸转移酶 AST 的活性 1 5 血常规检测 14 用日本东亚 Sysemx XT 1800I 血常规分析仪对白细胞进行无分类检测 包 括淋巴细胞 LYMPH 单核细胞 MONO 中性粒细胞 NEUT 嗜酸 性粒细胞 EO 嗜碱性粒细胞 BASO 1 6 流式细胞术进行淋巴细胞亚群分析 21 22 所有研究对象血细胞处理标本用三色流式细胞仪进行分析 具体方法如下 1 6 1 标本染色 取三支试管 依次标记为 1 号管 2 号管和 3 号管 1 号管中 依次加入 PE CY5 CD3 抗体 PE CD8 抗体和 FITC CD 抗体 4 各 10 l 2 号管 中依次加入 PE CY5 CD3 抗体 PE CD56 抗体和 FITC CD19 抗体各 10 l 3 号 管中依次加入 PE CY5 CD3 抗体 PE CD8 抗体和 FITC CD28 抗体各 10 l 以 上各管分别加入 EDTA 抗凝血 20 l 轻轻摇匀 置于室温避光 20min 加入 0 5ml 溶血素 室温避光 10min 1000r min 离心 5min 弃上清 再加入 1ml 磷 酸盐缓冲液 PBS 混匀 1000r min 离心 5min 弃上清 再加入 1ml1 多聚 甲醛溶液混匀固定细胞 置于 4 避光保存并于 24h 内用流式细胞仪进行检测 1 6 2 上机检测 流式细胞仪在使用前均经过光路与流路的校准 PMT 校准 颜色补偿 并有专业人员进行操作等质控步骤 每次检测 10000 个细胞 机器 自带软件分析出 CD3 CD3 CD4 CD3 CD8 CD3 CD19 CD3 CD56 CD3 CD8 CD28 和 CD3 CD8 CD28 细胞的百分比 1 7 各亚群淋巴细胞计数 通过血常规检测出研究对象外周血总的淋巴细胞绝对数 109 L 通过流式 细胞术检测得外周血淋巴细胞各群的百分比 根据下列公式计算出各亚群淋巴 细胞的绝对数 各亚群淋巴细胞绝对数 个 l 血液 淋巴细胞总数 109 L 各群淋巴细胞 百分比 103 CD3 CD8 CD28 细胞数 个 l 血液 CD3 淋巴细胞数 个 l CD3 CD8 CD28 细胞百分比 CD3 CD8 CD28 细胞数 个 l 血液 CD3 淋巴细胞数 个 l 血液 CD3 CD8 CD28 细胞百分比 15 1 8 统计学处理 由于资料不符合正态和方差齐性 因此采用非参数法 用 SPSS11 5 统计软 件 三组间比较采用成组设计的多个独立样本比较的秩和检验 Kruskal Wallis 法 两组间比较用两独立样本的秩和检验 Mann Whitney 法 所有统计 学检验均为双侧 显著水平设为 0 05 分析结果用中位数 最小值 最大值 表示 2 结果结果 2 1 肝功能测定结果 对 16 例 TCE 药疹样皮炎的病人血清 ALT 以及 AST 活性进行检测 发现 16 例病人中 ALT 水平升高者 15 例 93 33 AST 升高者 12 例 73 33 在接触对照 32 例 与非接触对照组 28 例 ALT 以及 AST 水平均在临床正 常参考值范围内 2 2 三组研究对象外周血白细胞五分类检测结果 16 例患者中外周血 LYMPH 有 6 例 37 5 高于正常参考值范围 1 例 6 25 低于正常参考值范围 MONO 有 6 例 37 5 高于正常参考值范围 NEUT 有 14 例 87 5 高于正常参考值范围 EO 有 8 例 50 高于正常参 考值范围 2 例低于正常参考值范围 BASO 有 8 例 50 高于正常参考值范 围 在接触对照组和非接触对照组体内上述指标均在正常参考值范围内 见表 1 2 1 获得 5 例病人在检测血常规前未接受任何治疗的血常规结果 5 例病人外 周血中性粒细胞 NEUT 水平均增高 为 6 26 12 80 平均 10 35 109 L 有 8 例病人在检测淋巴细胞亚群前有明确的激素治疗史 但激素的使用量不祥 2 3 三组研究对象之间淋巴细胞亚群绝对数的比较结果 总淋巴细胞数 T 细胞和 CD4 T 细胞绝对数均为病例组同时高于接触对照 组和非接触对照组 P0 05 NK 细胞绝对数为病例组 接触对照组 非接触对照组 组间差异有统 计学意义 P接触 16 对照组 非接触对照组 差异有统计学意义 CD8 CD28 T 细胞数病例组高于接 触对照组 差异有统计学意义 但病例组与非接触对照组间无统计学差异 B 细胞绝对数接触对照组高于非接触对照组 P0 05 见表 1 2 2 对 8 例经过激素治疗的病人与 8 例未经激素治疗的病例外周血淋巴细胞进 行比较分析 各亚群淋巴细胞 CD4 CD8 细胞比值 CD8 CD28 T CD8 T 以 及 CD8 CD28 T CD8 CD28 T 细胞比值均未见显著性差异 P 0 05 表 1 2 1 16 例 TCE 药疹样皮炎病人外周血白细胞五分类检测结果分析 LYMPHMONONEUTEOBASO 升高例数6 37 5 6 37 5 14 87 5 8 50 8 50 降低例数1 6 25 002 12 5 0 正常例数 9 56 25 10 62 5 2 12 5 6 37 5 8 50 注 LYMPH 淋巴细胞 MONO 单核细胞 NEUT 中性粒细胞 EO 嗜酸性粒细 胞 BASO 嗜碱性粒细胞 表 1 2 2 三组研究对象之间外周血淋巴细胞亚群比较 细胞亚群非接触对照组接触对照组病例组pp12P13P23 CD3 CD4 个 l 中位数579 70645 751089 51 0 0050 0120 0040 161 最小值 最大值 338 80 887 50 313 00 815 75 253 45 1821 38 CD3 CD8 个 l 中位数310 80533 91 916 65 0 00010 002 0 00010 002 最小值 最大值 107 80 826 20 221 00 846 72 252 00 1846 71 CD3 个 l 中位数1180 801226 462187 33 0 0010 0010 00010 315 最小值 最大值 657 80 1747 20 550 00 1576 80 653 05 4106 40 CD3 CD19 个 l 中位数199 50303 41 254 320 0270 5470 5430 003 最小值 最大值 95 70 386 40 115 50 476 90 32 48 976 50 CD3 CD56 个 l 中位数624 60362 69 187 66 0 00010 009 0 00010 002 最小值 最大值 98 40 1165 00 61 60 2647 30 13 98 775 71 CD3 CD8 CD28 个 l 中位 数 258 79135 78 241 34 0 0020 0020 6260 009 最小值 最大值 53 87 566 88 15 95 435 56 38 44 847 40 18 CD3 CD8 CD28 个 l 中位 数 196 11382 94 552 14 0 00010 028 0 00010 001 最小值 最大值 98 73 697 53 175 57 775 61 142 13 1650 71 LYMPH 个 l 中位数1900 002175 003020 00 0 0010 0050 0010 077 最小值 最大值 1100 00 2500 00 1000 00 3020 00 1240 00 4780 00 CD3 CD8 CD28 CD3 CD8 0 480 19 0 26 0 0010 1290 0260 001 最小值 最大值 0 48 0 11 0 82 0 04 0 68 0 10 0 60 CD4 CD8 中位数1 481 201 190 172 最大值 最小值 0 51 2 46 0 61 1 75 0 30 2 30 CD28 CD28 中位数0 920 28 0 34 0 0010 1720 0260 001 最大值 最小值 0 12 4 52 0 004 2 08 0 11 1 49 注 与非接触对照组比较 P 0 05 与非接触对照组比较 P 0 01 与接触对照组比较 P 0 05 与接触对照组比较 P 0 01 LYMPH 淋巴细胞总数 注 p 为三组之间 Kruskal Wallis 法检验的 p 值 p12 为病例组与接触对照组之间 Mann Whitney 法 检验 p 值 p13 为病例组与非接触对照组之间 Mann Whitney 法检验结果 p23 为接触对照组与非接触对照组之间 Mann Whitney 法 检验 p 值 3 讨论讨论 肝脏是 TCE 在体内代谢的主要器官 一般认为外源化学物在肝脏进行聚合 氧化 还原 氢化以及去甲基化等一系列的代谢过程 然后在全身多个脏器发 挥毒效应 关于 TCE 对 TCE 药疹样皮炎患者肝功能的影响在国内外均有报道 23 31 目前认为 TCE 的中间代谢产物水合氯醛和三氯乙酸均能引起肝脏损害 32 但本研究中病例与接触对照来自于相同工厂的相同车间 在暴露浓度相同的条 件下 16 例 TCE 药疹样皮炎病人均存在不同程度的肝损伤 而接触对照工人 肝功能检测指标均在正常参考值范围内 并且在对 TCE 药疹样皮炎的整个治疗 的过程中 随着皮疹的消退 肝功能恢复正常 28 所有这些均提示病例肝损伤 并非由于 TCE 和 或其代谢产物的直接毒作用 而是属于免疫介导的肝损伤 一般认为外周血白细胞分类计数的变化与机体疾病病程变化有着密切关系 在某些疾病的初期 急性期 恢复期各类白细胞比例不断的变化 另外 激素 也能导致机体白细胞和分类计数的变化 如激素使外周血中性粒细胞升高 33 而使血中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞减少 TCE 药疹样皮炎以激素治疗为主 本 研究中有 8 例病人在检测血常规前经过不同程度的激素治疗 然而结果显示有 50 的病例嗜酸性粒细胞增高 37 5 的病例淋巴细胞升高 此结果与激素作用 所致两类细胞减少的趋势恰好相反 87 5 的病例中性粒细胞升高虽与激素的作 用趋势相一致 但另外 5 例未经激素治疗的病人检查结果发现 外周血中性粒 细胞均升高 因此 本研究血常规的检测结果可以反映出患者在发病初期的基 本情况 并可以排除激素的影响 研究表明中性粒细胞的增多则与肝损伤密切 相关 中性粒细胞的增加可使肝损伤明显加剧 34 其通过 Mac 1 粘附于肝细胞 在趋化因子的作用下 启动蛋白酶的释放并持续生成活性氧 35 活性氧诱发肝 细胞内氧化应激 线粒体穿膜转运孔开放和线粒体膜电位崩落 引起肝细胞坏 死 36 本次研究中发现病例组有占 87 5 的病人中性粒细胞升高 提示 TCE 药 疹样皮炎的患者体内 通过活化的中性粒细胞释放出活性氧 诱导肝细胞的脂 质过氧化 进而导致肝脏的损伤 因此在该病的治疗期间要采取积极的治疗措 施 以防止肝功能衰竭而导致死亡 嗜酸性粒细胞参与机体的非特异性免疫反应 其主要特点之一是含有颗粒 大约 200 个 细胞 这些颗粒中含有强碱性的毒性蛋白 当嗜酸性粒细胞活化后 20 脱颗粒形成毒性阳离子蛋白和炎性介质 对浸润部位的组织和细胞产生强烈的 毒性作用 嗜酸性粒细胞是判断机体是否发生变态反应的简易指标 其能增强 皮肤炎症反应 与接触性皮炎发生部位的病例组织学改变之间具有密切关系 Satoh T 等 37 应用豚鼠接触性过敏反应模型 以 10 DNCB 致敏和 0 15 DNCB 涂抹耳部进行激发 12 小时耳部嗜酸性粒细胞数量显著增加 本研究虽然只检 测了病例血液中嗜酸性粒细胞升高 而未检测皮肤组织 然而研究表明 组织 中嗜酸性粒细胞浸润往往与外周血中嗜酸性粒细胞数量增多相关联 38 嗜酸性 粒细胞主要分布于呼吸道 消化道和泌尿生殖道粘膜组织中 当嗜酸性粒细胞 被激活后 脱颗粒释放出一系列生物活性介质 引起组织细胞的损伤 这一生 物学过程可以解释 TCE 过敏性皮炎病人出现的眼 口 生殖器等处的粘膜红肿 糜烂等损伤 39 另外 研究表明嗜酸性粒细胞浸润增多是由 T 细胞调控的继发 免疫反应 在药物引起的非速发型变态反应中 NIRs 活化的 T 细胞通过分 泌穿孔素 perforin PF 和颗粒酶 B granzyme B GrB 等细胞因子 来诱 导中性粒细胞 嗜酸性粒细胞以及角质细胞的活化 40 推测 TCE 药疹样皮炎患 者可能也是通过同样的机制导致外周血嗜酸性粒细胞的升高 尽管嗜碱性粒细胞 BASO 在外周血白细胞中所占的比例较小 接触对照组 非接触对照组 各组间 均有显著性差异 因此其只能作为反映 TCE 接触的指标 从 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞各自的免疫学功能来分析 CD4 T 细胞是辅助性 T 淋巴细胞 Th 细胞 其主要在体内启动超敏反应的发生 并通过分泌一系列细胞因子发挥 作用 CD8 T 淋巴细胞与细胞毒作用有关 其可以清除体内受感染的细胞并分 泌 IFN 和 IFN 55 CD8 T 细胞根据其表面是否表达 CD28 分子又可以分为细胞毒 T 细胞 CD8 CD28 CTL 和抑制性 T 细胞 CD8 CD28 Ts 56 57 前者的主要功能是 杀伤靶细胞 CD28 分子组成性表达于 T 细胞表面 外周血中几乎所有 CD4 T 细胞和 50 的 CD8 T 细胞表达 CD28 其作为协同刺激因子 在辅助 T 淋巴细 胞的活化 增殖并产生细胞因子 如 IL 2 IFN IL 1 IL 4 IL 5 和 TNF 方 面起着重要作用 在 T 细胞活化的过程中 倘若没有 CD28 信号 T 细胞将呈 现无反应性或反应无能 58 59 因此 只有 CD8 CD28 T 淋巴细胞才可能被活化 增殖为效应性 T 细胞 本研究发现 接触对照组外周血 CD8 CD28 T 淋巴细胞 与病例组和非接触对照组工人相比均显著降低 p 0 01 接触对照组与病例组 22 CD8 CD28 T CD8 T 比值均低于非接触接触对照组 但接触对照组更低 提示 该组 CD8 T 细胞总数的升高其主要贡献来源于 CD8 CD28 T 细胞的升高 CD8 CD28 T 细胞是调节性 T 细胞的重要组成之一 其可以通过阻止抗原提呈 细胞表面 B7 分子的上调而抑制 CD4 Th 细胞的活化增殖 60 且比 CD8 CD28 T 淋巴细胞具有更强大的溶解细胞的作用 并能分泌更多的 IFN 61 63 在维持自身免疫耐受 逃避自身免疫反应方面发挥重要作用 64 提示在 接触对照组工人体内正是由于 CD8 CD28 T 细胞作为调节性 T 细胞 发挥了维 持自身免疫耐受的作用 从而使接触对照组工人虽然接触 TCE 但并未发生药疹 样皮炎 但当 TCE 的免疫毒性超出了 CD8 CD28 T 细胞的调节能力 同时 TCE 通过诱发 CD4 T 细胞的增殖而启动超敏反应 则导致 TCE 接触工人发生药疹 样皮炎 T 细胞亚群中的 CD4 T 细胞与 CD8 T 细胞的相互制约及平衡对机体免疫应 答具有重要的调节作用 CD4 T CD8 T 细胞比值是评估体内免疫调节状态的常 用参数 其比例失调可导致免疫紊乱及免疫病理改变 越飞等 48 用 CD4 CD8 测定试剂盒的方法 通过对 11 名三氯乙烯药疹样皮炎的患者和 11 名健康体检 者的研究中 发现病例组 CD4 CD8 比值较正常人无显著性差异 动物实验研 究发现 三氯乙烯致敏小鼠脾淋巴细胞 CD4 CD8 比值与溶剂对照组小鼠相比 无显著性差异 65 这些研究结果与本实验结果相一致 但杨志前 66 的研究中发 现三氯乙烯药疹样皮炎患者体内 CD4 CD8 细胞比值明显减低 文章同时指出 糖皮质激素作为免疫抑制剂 可以诱导包括淋巴细胞在内的多种细胞的凋亡 并且将激素用于不同疾病的治疗前后 患者的外周血 T 淋巴细胞有不同的变化 并有文献报道 大剂量糖皮质激素可通过糖皮质激素受体诱导淋巴细胞的大量 凋亡 67 而小剂量糖皮质激素可降低外周血 CD4 T 淋巴细胞凋亡率 68 由此表 明 以上研究结果的不一致性 可能是由于实验方法 研究对象的不同 也可 能与疾病的不同进展阶段及激素的治疗有关 CD56分子表达于95 以上的NK细胞表面 NK细胞作为体内天然淋巴细胞 对体内感染和转化的细胞具有强大而快速的天然免疫应答能力 并参与一系列 适应性免疫反应 69 研究表明NK细胞与接触性过敏反应的发生密切相关 比如 金属镍所致迟发型超敏反应的小鼠脾脏中NK细胞显著减少 70 71 本研究也发现 23 三组研究对象外周血NK细胞数呈现病例组 接触对照组 正常人对照组的趋势 P 0 05 NK细胞为胸腺非依赖细胞 NK细胞的缺乏将易导致病毒感染特别 是疱疹病毒的感染 72 73 黄汉林对59例TCE药疹样皮炎的病人和59例与之年龄 匹配的健康工人对照的血清中9种抗体滴度进行检测 结果发现病例组血清 14 59 人中人类疱疹病毒 6的抗体滴度显著升高 对照组无一人异常 P 0 001 74 由此可见 NK细胞作为机体的天然免疫屏障 其水平的降低 在TCE药疹样皮炎合并病毒感染过程中起重要作用 总之 TCE 药疹样皮炎是由多种免疫细胞参与的复杂的免疫反应 TCE 药 疹样皮炎患者外周血淋巴细胞各亚群数量与接触对照组和健康人对照之间有差 异 其中总淋巴细胞 T 细胞和 CD4 T 细胞计数升高可初步确定作为疾病早期 的临床筛检指标 CD8 T 细胞增多与 CD8 CD28 T 细胞以及 NK 细胞数量的降 低可初步确定为 TCE 的接触效应指标 但该结论尚需扩大样本量进行进一步验 证 本研究结果促使作者进一步思考 淋巴细胞亚群的变化是否是 TCE 免疫毒 作用的结果 当这种变化发展到一定的阶段 导致了过敏性皮炎的发生 如果 是这样 为何病例在接触 TCE 短短的时间内即发生了如此巨大的变化 而其他 接触工人接触时间更长却未患病 是否病例与健康接触者体内具有不同的维持 免疫平衡的机制 在下一节中将针对这一问题进行探讨 24 第三节第三节 Fas FasL 与与 PF GrB 介导的介导的 TCE 免疫毒作用机制探讨免疫毒作用机制探讨 细胞毒性 T 细胞 cytotoxic T lymphocyte CTL 包括 CD4 CTL 与 CD8 CTL 两群细胞通过杀伤靶细胞介导细胞毒性反应 75 79 为诱导皮肤炎症 反应的重要效应细胞 80 可能在 TCE 药疹样皮炎病人皮肤及肝脏等组织器官的 病理学损害中发挥主要作用 CD4 CTL 胞毒作用的主要机制是通过 Fas FasL 途径介导细胞凋亡 Fas 即 C