RNAi 技术原理.ppt

RNAi的实验方法 细胞生物学樊国达2014 11 14 目录 miRNA的原理及机制RNAi的机制及与miRNA的关系RNAi实验的三大基本路线RNAi机制的缺陷 miRNA的原理 MicroRNAs miRNAs 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA 其大小长约20 25个核苷酸 成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的 随后组装进RNA诱导的沉默复合体 RISC 通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA 并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译 最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径 包括发育 病毒防御 造血过程 器官形成 细胞增殖和凋亡 脂肪代谢等等 miRNA如何行使功能 与mRNA的3 端非编码区特定位点 其第2 8个核苷酸 绑定 与mRNA完全互补时 会引发mRNA降解 不完全的与mRNA配对时 会引发转录后的基因沉默 抑制靶基因的表达 从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程 miRNA途径 miRNA可以降解mRNA 或者抑制mRNA翻译蛋白质 RNAi借用了天然的miRNA作用途径 RNAi作用机制 RNAi实验三大基本路线 线路一 非哺乳动物细胞体系的RNAi实验和选择 比如果蝇 线虫 拟南芥等低等生物和植物 由于不涉及抗病毒免疫应答反应 通过体外转录即可制备目标基因的dsRNA 200bp左右 直接用长双链RNA进行RNAi实验 1 构建目的基因载体 选取目的基因的特异性序列 约200bp 300bp 构建到T载体上 2 使用5 端连接有T7启动子的引物PCR扩增目的基因 得到两端均连接有T7启动子序列的目的基因片段 3 T7RNA聚合酶进行转录 dsRNA ssRNA DNA模板 4 加入Rnase和Dnase消除ssRNA和DNA模板 5 离心纯化dsRNA siRNA导入细胞的方法 对于线虫而言 线路二 哺乳动物细胞RNAi实验 siRNA的设计 合成 哺乳动物细胞导入30bp以上的长双链RNA dsRNA 往往会诱发非预期的抗病毒应答反应 所以不能用体外合成的dsRNA直接导入细胞 常见的做法之一是直接制备19 27bp左右的siRNA 然后再将siRNA转入哺乳动物细胞 siRNA的转染 哺乳动物转染的常见方法有 磷酸钙共沉淀 电穿孔法 机械法 例如 显微注射和基因枪 阳离子脂质体试剂 其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法 siRNA的转染 有些研究人员发现 携带siRNA的脂蛋白纳米颗粒通过内吞作用进入细胞 一旦纳米颗粒进入细胞 就会被捕获在小泡中 这阻碍了大部分siRNA接近位于细胞质的目标mRNA 甚至会在一小时内将其分解并排出细胞 siRNA的转染 研究显示 在纳米颗粒的再利用过程中 蛋白NPC1是一个主要因子 没有这一蛋白 纳米颗粒就不会被细胞排出 让siRNA有更多的时间去结合目标mRNA NPC1缺乏时会出现交通拥堵 这样siRNA就有更多的时间逃逸出来 但也会影响细胞的其他生理活动 所以现在大部分研究人员都在通过改进脂蛋白纳米颗粒的结构 来增强siRNA的转染效率 线路三 shRNA表达载体和病毒载体 这类载体都包含有一个RNA聚合酶 启动子和一个4 5个连续的T构成的转录终止位点以及选择标记 选用Pol 启动子是因为此启动子总是在距其一定距离的位置起始转录 而遇到4 5个连续的T就终止转录 并且终止于转录终止位点第二个碱基处 十分精确 此法需首先化学合成一段编码siRNA正义和反义链的模板 正义与反义序列之间由一段环 1oop 序列隔开 插入载体Pol 启动子下游 然后转入细胞 环序列可使转录出的RNA链折叠成具发夹结构的小RNA分子 shRNA 这些小RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA RNAi作为一种重要的基因转录后沉默机制 广泛应用于基因功能研究 肿瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究 其核心内容是siRNA能够抑制同源基因的表达 对于siRNA而言 现在颇有争议的地方在于它对靶基因的沉默特异性 主要体现在两个方面 1 脱靶效应 2 打破内源性miRNA的平衡 RNAi机制的缺陷 脱靶效应 即siRNA对靶基因的沉默并不一定严格按照序列特异性方式进行 1 对于21 23nt的siRNA 只需少至7nt的序列与mRNA同源 均可导致该基因的沉默 2 诱导机体或细胞产生天然或获得性免疫应答 被一些蛋白酶降解 从而降低siRNA对靶基因的特异性 降低siRNA脱靶效应 1 要减少脱靶效应 可以将针对同一mRNA的不同siRNA混合起来使用 这些siRNA作用于同一个目标 每种siRNA的浓度得以降低 稀释了各自的脱靶效应 但不损害靶的特异性敲除 2 对siRNA的化学修饰 siRNA的化学修饰主要有三类 磷