基因组学

第2章遗传图绘制 2 1遗传图与物理图2 2遗传作图标记2 3遗传作图的方法 2 1遗传图与物理图 一 为何要绘制遗传图与物理图 基因组测序的策略 由上至下 左 和由下至上的测序 右 为何要绘制遗传图与物理图 1 全基因组测序时 基因组太大 必需分散测序 然后将分散的顺序按原来位置组装 需要图譜进行指导 基因组存在大量重复顺序 会干扰排序 因此要高密度基因组图 2 由于一些分子标记同基因座位紧密连锁 为靶基因的图位克隆 mapbasedcloning 提供了可能 3 遗传图和物理图各有优缺点 必须相互整合校正 二 遗传图与物理图 1 遗传作图 Geneticmapping 采用遗传学分析方法将基因或其它DNA分子标记标定在染色体上构建连锁图 这一方法包括杂交实验 家系分析 遗传图距单位为厘摩 cM 每单位厘摩定义为1 交换率 2 物理作图 Physicalmapping 采用分子生物学技术直接将DNA分子标记 基因或克隆标定在基因组实际位置 物理图的距离依作图方法而异 如辐射杂种 radiationhybrid 作图的计算单位为厘镭 cR 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度 即碱基对 bp kb 3 基因组图 Genomemap 遗传图与物理图通过共同的标记可以相互校正 由此获得的连锁图称为基因组图 2 2遗传作图的标记 全基因组鸟枪法测序和基于克隆物理图的测序都必须要有高密度的标记 理想的遗传作图标记 2 2 1基因标记 1 可见表型性状 如果蝇遗传图上显示的躯体颜色 翅膀形状等标记 2 生化特征表型 如人类血型系列分析 基因标记并非理想的标记 因为 可用作标记的基因十分有限 许多性状都涉及多基因 用基因做标记将在遗传图中留下大片的无标记区段 因为存在大量的基因间区 1 第一代分子标记 以分子杂交为基础 以RFLP为代表2 第二代分子标记 以PCR为基础 以SSR为代表 包括RAPD AFLP SSCP3 第三代分子标记 以基因序列为基础 以SNP为代表 2 2 2DNA标记 一 第一代分子标记 RFLP RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphism限制性片段长度多态性 一 什么是RFLP标记 1 由于同源染色体同一区段DNA序列的差异 当用限制酶处理时 可产生长度不同的限制性片段 EcoRIwillnotcutthissquence Var A Var B 什么是RFLP标记 2 什么是RFLP标记 3 CuttingDNAintosmallerfragmentsbyrestrictionenzymesSeparatingfragmentsbygelelectrophoresisTransferringDNAfragmentstoafilter southenblottingVisualizingDNAfragments 二 RFLPmethodology DNAfragmentsseparatedbyagarosegelelctrophoresis SeparatedDNAfragmentsblottedontonitrocellulosepaper A B Southernblotting LabeledDNAprobehybridizedtoseparatedDNA LabeledDNAprobehybridizedtocomplementaryDNAbandsvisualizedbyautoradiography C D E 1 Pointmutation 三 ReasonsonRFLP 1 2 Deletion ReasonsonRFLP 2 3 Insertion ReasonsonRFLP 3 四 RFLP的优缺点 重复性好共显性标记 TimeconsumingUseofradioactiveprobes 二 第二代分子标记 1 SSR SSR SimpleSequenceRepeat简单序列重复 一 什么是SSR标记 在同源染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同 小卫星序列 minisatellite 又称可变串联重复 variablenumberoftandemrepeats VNTR 重复单位较长 为数十个核苷酸 微卫星序列 microsatellite 又称简单串联重复 simpletandemrepeats STR 重复单位较短 为1 6个核苷酸 注 微卫星序列是常用的分子标记 二 SSR的类型 三 如何寻找SSR标记 1 计算机搜寻 2 用Sau3A RsaI HaeIII或AluI限制酶酶切基因组DNA 构建DNA文库 合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选 3 根据简单重复顺序两侧的序列设计引物 经聚丙烯胺凝胶电泳分辩 四 SSR的特点 多态性频率高分布比较均匀共显性标记检测方法简单 重复性好 五 MultiplexassayofSSR OverthreemarkerscanbecopiedatonceSensitivitiestosmallamountofDNADifferentfluorescentdyesusedtodistinguishalleleswithoverlappingsizeranges SSR GELELECTROPHORESIS AccuratecharacterizationofsizesandpeaksofSSRalleles GENESCAN GENOTYPER ABI377DNAsequencer NatureBiotech18 233 234 2000 UniversalSSR RandomAmplifiedPolymorphicDNA随机扩增多态性DNA适合对缺乏DNA序列信息的物种的分子标记 第二代分子标记 2 RAPD 采用随机的单个引物 引物长度在10bp左右 DNA变性后 进行随机扩增 RAPD结果分析 RAPD的优缺点 AmplifiedFragmentLengthPolymorphsim扩增片段长度多态性 第二代分子标记 3 AFLP 一 AFLP标记的技术原理 AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法 基因组DNA经限制性内切酶酶切后 产生分子量大小不同的限制性片段 使用特定的双链接头 adaptor 与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板 用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增 只有那些与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增 二 AFLP标记的技术流程 1 DNA的酶切 为了使酶切片段大小分布均匀 一般采用双酶酶切 在基因组上分别产生低频切口 EcoRI 和高频切口 MseI 2 与人工合成的寡聚核甘酸接头 adapter 连接 3 选择性扩增酶切片段 AFLP引物包括与人工接头互补的核心序列 CORE 限制性内切酶识别序列 ENZ 和3 端选择性碱基三部分 一般用带1个选择性碱基的引物进行预扩增 然后用带2 3个选择性碱基的引物进行再扩增 PreselectiveAmplification Primersusedinthisstepconsistofacoresequence anenzymespecificsequenceandaselectivesingle baseextensionatthe3 end Thesequencesoftheadaptersandrestrictionsitesserveasprimerbindingsitesforthe preselectivePCRamplification SelectiveAmplification Selectiveprimersareeitherradio labeledorfluorescently labeled Theyconsistofanidenticalsequencetothepreselectionprimersplustwoadditionalselectivenucleotidesatthe3 end i e atotalofthreeselectivenucleotides Twoadditionalnucleotidescanbeanyofthe16possiblecombinationsofthefournucleotides 4 AFLP标记的统计 AFLP产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳检测样品的多态性 可灵敏地分辨只有一个碱基差异的不同DNA片段 AFLP标记的技术流程图 三 AFLP标记的特点 1 DNA需要量少 检测效率高 理论上可产生无限多的AFLP标记 2 多态性高 3 可靠性好 重复性高 4 对DNA模板质量要求高 对其浓度变化不敏感 三 第三代分子标记 SNP SNP SingleNucleotidePolymorphism单核苷酸多态性 SNP 同源DNA序列中同一碱基位置含有不同的核苷酸 其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1 一 SNP的定义 类型 分布和特点 单个碱基的变换 单个碱基的转换 transition 如T C和A G 单个碱基的颠换 transversion 如A C T G G C和A T碱基的插入 缺失 indels 二 SNP的类型 因为这种变异可以是转换也可以是颠换 理论上讲 SNP既可能具有2等位多态性 也可能具有3或4等位多态性 但3或4等位多态性的情况较少见 通常所说的SNP都是2等位多态性 转换的发生率总是明显高于其他几种变异 属于转换型变异的SNP约占全部SNP的2 3 在单个基因或整个基因组中SNP的分布不均匀 在非转录序列中要多于转录序列 而且在转录区也是非同义突变的频率比同义突变的频率低得多 三 SNP标记的分布 在基因编码区的SNP称为编码SNP codingSNP cSNP 它又分为两类 未引起蛋白质编码氨基酸序列改变的同义编码cSNP synonymouscSNP s cSNP 和引起蛋白质编码氨基酸序列改变的非同义编码cSNP nonsynonymouscSNP ns cSNP ns cSNP会导致蛋白质功能的改变 在标记功能基因和研究基因的遗传效应等方面具有重要意义 因此它的研究备受关注 cSNP 四 SNP的特点 数量多 分布广泛 平均每1kb就有一个SNP 遗传稳定性高 遗传分析重现性好且准确性高 易于快速且高通量地进行基因型分型 由于SNP的二态性 非此即彼 在基因组中往往只需 的分析 SNP只有两种等位基因型 在个体中的多态信息量比SSR等多等位基因型的信息量少 对植物SNP的研究主要分两个层次 在样本中对目的性状相关SNP的发现 Discovery 在群体中对已知位点的SNP进行分型 genotyping 结合群体的表型分析 获得目标性状的基因标记 五 SNP的发现和分型 SNP的发现方法 SNPdiscovery 1 不同个体的PCR扩增片段直接测序是发现SNP的最常用方法 2 基于公共数据库的直接方法也常用来搜索新的SNP 如利用拟南芥数据库发现了37344个SNP 3 基因芯片技术也被用于SNP的发现 直接测序法 SNP的分型 SNPgenotyping 因为是在大群体中进行已知SNP分型 测序法就比较昂贵 必需寻找便宜 高通量的检测方法 对SNP进行基因型分型的主要技术包括微测序 多重反向点杂交 DNA芯片或微阵列以及基质辅助激光解吸附电离飞行时间 MALDI TOF 质谱法等 目前用得较多的是微测序 Singlebaseextension SBE Oligonucleotideligationassay OLA Directhybridization DH Minisequencingprimer DNApolymerase A T 5 Singlenucleotideextension G X 5 Noextension T C Allele specificprimers DNApolymerase A T 5 Match extension G T 5 Mismatch noextension Allele specificprimerextension ASPE T C 5 5 A T 5 G T 5 Allele specificligationprobes Adjacentligationprobe Ligase Match ligation Mismatch noligation T C 5 5 Allele specificoligonucleotideprobes A T G T Matchstable Mismatchunstable FourSNPgenotypingprinciples 四 多态性信息量 PIC 多态性信息量 polymorphicinformationcontent PIC 用来表示群体中某一位点多态性的程度 即多态性组成频率 aPICvalueoflessthan0 25indicatinglowpolymorphism avaluebetween0 25and0 5averagepolymorphismandavaluehigherthan0 5ahighlypolymorphiclocus分子标记按多态性频率大小排列 SNP SSR RFLP PIC的计算 PIC的计算公式 由Bostein提出 PICi 1 Pij2PICi指分子标记i的多态性信息量 Pij指i标记中第j个类型所发生的频率 n j 1 例子1PICi 1 Pij2Markerahastwoalleles firstallelehasafrequencyof50 thesecondallelehasafrequencyof50 PICa 1 0 52 0 52 1 0 25 0 25 0 5 n j 1 例子2PICi 1 Pij2Markerbhastwoalleles firstallelehasafrequencyof90 thesecondallelehasafrequencyof10 PICb 1 0 92 0 12 1 0 81 0 01 0 18 j 1 n 例子3PICi 1 Pij2MarkerAhastwoalleles firstallelehasafrequencyof30 thesecondallelehasafrequencyof70 PICc 1 0 32 0 72 1 0 09 0 49 0 42 n j 1 例子4PICi 1 Pij2MarkerDhas10alleles eachallelehasafrequencyof10 PICd 1 10 x0 12 1 0 1 0 9 n j 1 五 分子标记在植物育种中的应用 1 遗传图谱的构建 遗传连锁图谱可为基因定位 物理图谱构建和以图谱基因克隆奠定基础 2 有助于将遗传图谱和物理图谱进行进一步的整合 物理图谱通常是由BAC克隆的重叠群组成 可以通过检测BAC末端的重复序列来发现标记 然后再将这些来自BAC末端的标记进行遗传作图 从而达到将遗传图谱和物理图谱进行整合的目的 3 品种类型 纯度及真伪的判别 通过检测品种的指纹片段可以有效鉴定品种的纯度和真伪 为品种基因型的鉴定提供了一条新的途径 4 分子标记辅助选择育种 Marker assistedselection MAS 如果目标基因与某个分子标记紧密连锁 那么通过对分子标记的检测 就能获知目标基因的基因型 因此 在育种中就可以借助分子标记对目标性状的基因型进行选择 5 基于连锁不平衡的关联分析 一 什么是连锁不平衡 连锁不平衡 linkagedisequilibrium LD 或等位基因关联 allelicassociation 指的是一个群体内不同座位等位基因之间的非随机关联 连锁不平衡与连锁是相关但完全不同的两个概念 连锁不平衡指的是群体内等位基因之间的相关 而连锁指的是位于同一条染色体上的基因联合传递的现象 连锁与连锁不平衡 二 连锁不平衡的度量 LD统计的是实际观测到的单倍型频率与随机分离时单倍型的期望频率之间的差异 假设有两个连锁的座位A和B 其等位基因分别为A a和B b 4个等位基因的频率分别为 A a B b 4种单倍型AB aB Ab和ab的频率分别为 AB aB Ab和 ab 那么 实际观测到的单倍型频率与期望单倍型频率之间的差异D的计算公式为 D 的计算公式 r2的计算公式 用r2和D 来估计两个座位之间的LD水平 r2和D 反映了LD的不同方面 r2包括了重组史和突变史 而D 仅包括重组史 D 能更准确地估测重组差异 但样本较小时发现低频率4种等位基因组合的可能性大大减小 因此D 不适宜小样本研究中的应用 r2可以提供标记是否能与QTL相关的信息 因此LD作图中通常采用r2来表示群体的LD水平 三 基于LD的关联分析 关联分析 associationanalysis 主要是研究群体中的分子变异与表型变异之间的相关关系 可以用于鉴定导致生物特定性状 如人类疾病 的基因 关联分析的基本原理在于首先确定一批按一定间隔存在 覆盖整个基因组的标记 然后在特定群体中寻找这些标记与待研究特征之间的关系 即确定与特征相关的标记 从而确定导致生物出现特定性状的基因组区域 LD决定了关联分析的方法 如果目标群体在很长的物理距离内存在LD 那么此群体适宜采用基于全基因组扫描的策略 相反 如果目标群体的LD在很短的物理距离内迅速衰退 则此群体适宜采用基于候选基因的高分辨率LD作图策略 四 关联分析和传统遗传分析比较 2 3遗传作图的方法 2 3 1部分连锁与遗传