禽流感疫胶体金快速检测技术研究

禽流感免疫胶体金快速检测技术研究 研究的背景和意义AI爆发时来势凶猛 新型毒株的出现和致病力的增强等特点始终威胁着畜牧业和人类健康 对禽流感进行实时监测已成为畜禽疾病检测的重要内容 禽流感的检测方法虽然已有较多报道 但多数方法需要特殊的仪器设备 且在灵敏性 特异性等方面存在不同差异 多数方法只能在实验室中完成 因此急需建立一种适合基层使用的禽流感快速检测方法 免疫胶体金层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来的一种快速免疫学检测技术 近几年该技术已经引起兽医界的重视 猪瘟免疫抗体 口蹄疫抗体 猪伪狂犬病抗体快速检测及鸡传染性法氏囊快速诊断等均有用相关免疫胶体金层析测试条进行快速检测的试验 禽流感免疫胶体金测试条可在十几分钟内实现对禽流感的快速检测 该测试条在国外已有生产 我国还未见有相关研究的报道 本试验将免疫胶体金诊断技术用于AIV的检测 该方法的确立将为实现临床快速 准确诊断禽流感提供有效检测方法 研究内容 1 通过对抗AIVMcAb 羊抗AIV多克隆抗体的制备 获得高效价的单抗和多抗 2 制备性能稳定 免疫学活性好的金标AIVMcAb 并将其将其固定于玻璃纤维膜上作为显色源 将抗AIV多克隆抗体结合于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体 制备AIV免疫胶体金层析测试条 初步建立AIV免疫胶体金层析法 通过与双抗体夹心ELISA比较 对AIV免疫胶体金层析法作出评定 BALB c鼠 细胞融合 筛选 制备 鉴定 提纯单克隆抗体 间接ELISA法 建立AIV免疫胶体层析法 禽流感抗原免疫动物 比较 采小鼠脾脏集小鼠血清 羊 对AIV免疫胶体金层析法作出评定 制备金标抗体 技术路线 制备羊抗AIV多克隆抗体 胶体金颗粒的制备 确定最适标记量 标记条件 结合垫上喷涂金标抗体 购进羊抗鼠IgG 处理结合垫及样品垫 NC膜上喷涂各种抗体 建立禽流感夹心ELISA诊断方法 免疫胶体金测试条的组装 试验一抗AIVMcAb的研制 AIV抗原的纯化及鉴定BALB c小鼠的免疫阳性McAb筛选方法的建立细胞融合及培养McAb的大量制备及生物学特性鉴定 McAb的Ig亚型鉴定 McAb特异性鉴定试验 McAb的提纯及效价测定 标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶SephadexG 200柱层析 分次收集并测定各管蛋白含量 经过0 01mol LPBS pH为7 4 洗脱 所得的洗脱峰如图 AIV的分离纯化 收集61 78号管内样品 用国外标准禽流感胶体金试纸条初步鉴定结果如图 AIV胶体金试纸条鉴定结果 待检样 阴性对照 AIV10 SDS PAGE鉴定结果 123 1 泳道为提纯提纯前AIV抗原 2泳道为提纯后AIV抗原 3泳道为蛋白质Marker 间接ELISA抗原与抗体的工作浓度的确定 抗原工作浓度为10 g ml 一抗的工作浓度为1 8000 融合前后细胞形态观查 SP2 03d5d 6d8d 细胞融合及筛选 选择其中OD450值较高的孔进行亚克隆 采用有限稀释法 经过反复筛选及二次亚克隆获得两株能稳定分泌抗AIV抗体的杂交瘤细胞株 分别命名5A6 5G7 McAb的Ig亚型鉴定试纸条的G1 区各出现一条清晰的条带 表明单抗的亚型属IgG1 型 McAb的提纯 123单抗提纯SDS PAGE电泳图注 1 2泳道为提纯AIVMcAb 3泳道为蛋白质Marker McAb交叉间接ELISA试验结果 提纯腹水效价间接ELISA测定结果 小结 1 本试验用提纯的禽流感标准抗原通过间接ELISA法筛选最终获得了两株抗禽流感McAb细胞株 将其命名为5A6 5G7 特异性试验证明所获得的两株杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性针对禽流感抗原的共同表位 2 对单抗采用乳胶凝集试剂条进行亚型鉴定 结果表明单抗的亚型属IgG1 型 采用辛酸 硫酸铵提取IgG1型的单抗的方法 达到了较满意的结果 提纯后的单抗特异性好 效价高 可直接用于胶体金标记 将在AIV的诊断和检测发挥重要作用 试验二禽流感免疫胶体金层析法的建立 羊抗AIV抗体的制备制备胶体金颗粒 金标抗体 免疫胶体金测试条的组装免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择 羊抗AIV抗体效价测定 1 2 琼扩试验效价1 8以上 1 4 1 8 1 16 1 32 不同胶体金颗粒标记抗体效果如表所示 40nm的胶体金很不稳定 制备起来很困难 容易产生沉淀 20nm的胶体金灵敏度较差 30nm的胶体金稳定性 灵敏度均较好 抗体最适稳定量 空白51015202530354045 目测法结果如图所示 使胶体金的红色不变的最低抗体稳定量是15 g ml 在此基础上再加上20 即为稳定所需抗体的实际用量 18 g ml 加入抗体后反应时间的确定金颗粒中加入最佳量的抗体后不同反应时间的标记结果表明 在70min以上的胶体金溶液存放半年以上无沉淀产生 而45min和60min标记的金颗粒分别在3个月 5个月出现沉淀 因而选择标记时间为70min 金标抗体的稳定剂的选择BSA稳定的标记胶体金 放在4 达1年以上半仍然保持良好性能 而用PEG稳定的标记胶体金放在4 4个月左右就有分层现象 且灵敏度亦下降 因此 选择BSA作稳定剂 金标抗体的保存液的选择2mMpH8 2硼酸缓冲液中以含5mMNaCl 1 BSA作保存液的胶体金 稳定性良好 半年内未出现沉淀 含5mMNaCl 10 蔗糖保存的胶体金半年内出现沉淀 含5mMNaCl 20 蔗糖保存的胶体金 2月后出现沉淀 结合垫处理液的选择 编号为 的结合垫处理液浸泡过的玻璃纤维膜释放金标抗体的效果最好 样品垫处理液的选择 编号为 的液体处理的样品垫加样后 样品垫上的流速快慢适中 符合要求 约10min内样品从测试条加样端流到吸水纸端 且可在一定程度上控制非特异性反应 金标抗体 羊抗AIVIgG 羊抗鼠IgG喷涂量的确定 7号效果最好 当稀释100后OD520 0 62的金标抗体喷量为2 0 l cm 羊抗AIVIgG 5 0mg ml 喷量0 75 l cm 羊抗鼠IgG 8mg ml 喷量为1 0 l cm时检测线 质控线最为清晰 123456789阴性 测试方法与评判取待检样品50ul 滴于测试条的加样区 待测样品按如图所示的方向 通过层析作用 从加样区经过检测线 质控线 最后到达吸附区 反应经过10 15min即可判定结果 反应区 样品层析方向 质控线 检测线 AIV检测的评判标准 阳性阴性 试纸条上出现两条红色为AIV阳性 若只有对照线为红色则判为阴性 两条线均无显色为测试条失效 稳定性试验 1d3d5d7d8d 37 放置1d 3d 5d 7d后的检测结果无明显差别 37 放置8d天后检测线不清晰 4 放置1 2 3 4 5 6个月后的检测结果无明显差别 4 放置7个月检测线不清晰 小结 成功地制备了30nm的胶体金颗粒 并制得了稳定的金标McAb 初步建立了免疫层析装置中各系统的稳定反应体系 利用抗AIV单抗及羊抗禽流感多抗初步建立了用于检测AIV的免疫胶体金层析检测法 该方法具有一定的灵敏度 操作简便 反应快速 特异性强等特点 试验三AIV免疫胶体金层析法与夹心ELISA法的比较 建双抗体夹心ELISA方法AIV免疫胶体金层析法与双抗夹心ELISA法的比较 灵敏度试验 特异性试验 准确度试验 重复性试验 夹心ELISA法的程序表 Ab1 Ab2最佳工作浓度的选择的确定 用已知AIV标准抗原和阴性抗原进行了方阵滴定 3次重复 结果分析表明 选择Ab1浓度为1 25 g ml Ab2稀释度为1 32000为最佳工作浓度 灵敏度试验 以不同浓度AIV标准抗原 做灵敏度试验 以OD450值为纵坐标 抗原浓度为横坐 制备标准曲线如图 线性检测范围在7 5ng ml 500ng ml 其线性良好 最低检测下限为3 75ng ml 对不同稀释浓度的AIV标准抗原进行检测 重复检测16次 浓度在7 5ng ml 500ng ml的结果为阳性 在7 5ng ml与3 75ng ml之间设7ng ml 6 5ng ml 6 0ng ml 5 5ng ml 5ng ml 4 5ng ml 4 0ng ml几个浓度度 再次进行检测 当抗原浓度为5ug ml时检测线反应结果较明现 抗原浓度为4 5ng ml时反应结果不明显 初步判定AIV免疫胶体金层析法检测的灵敏度为5ng ml 76 56 05 554 54 03 75阴性 AIV免疫胶体金层析法灵敏度测定结果 特异性试验 夹心ELISA法 AIV免疫胶体金层析法检测NDV IBV IBDV MDV和禽流感标准抗原 用PBST液作空白对照 结果如下 双抗体夹心ELISA方法与AIV免疫胶体金层析法 特异性强 与其他禽病呈阴性反应 AIVNDVMDVIBVMDV空白 准确度试验 对标准曲线抗原高 中 低三个浓度的平均OD值检测 结果表明平均回收率为97 63 说明所建立的双夹心ELISA法具有较高的准确度 在作为对照试验时可信度较高 保证了在进行检测时其他指标的可靠性 注 OD值1为相应标准抗原浓度对应的值OD值2为在相应抗原浓度下实际检测所得值 精确度试验 对不同浓度标准AIV抗原在不同批次的检测结果如上 用双夹心ELISA法检测平均OD450值 批内平均变异系数为4 99 批间平均变异系数为5 92 AIV免疫胶体金层析法的阳性检出率 批内平均变异系数为3 83 批间平均变异系数为4 89 表明这两种方法重复性好 符合率高 说明二者具有较高的重复性 其性能稳定 小结 建立了AIV双抗夹心ELISA法 作为胶体金试剂条检测法的参比方法 其线性良好 线性检测范围在7 5ng ml 500ng ml 最低检测下限为3 75ng ml 该方法具有灵敏度高 特异性强 准确度高 重复性好等特点 通过与AIV双抗夹心ELISA法比较研究表明 本试验所建立的AIV免疫胶体金层析法在检测AIV时 可检测出的下限是5ng ml 与双抗体夹心ELISA法无显著差异 对其它禽病不发生特异性反应和假阳性反应 具有快速 灵敏 稳定等特点 能够特异性地检测AIV 适合于基层现场检测 全文总结 1建立了用于筛选AIVMcAb的间接ELISA方法 2通过细胞融合 获得了2株能稳定分泌AIVMcAb的杂交瘤细胞株 命