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3 11蛋白质的分离 纯化和鉴定 一 细胞破碎 动物细胞 电动捣碎机 匀浆器 超声波破碎法植物组织 匀浆器 石英砂研磨微生物 溶菌酶 超声波 二 抽提 选择合适的溶剂避免目的蛋白质的变性在低温下进行 三 分离 盐析法 常用硫酸铵 氯化钠 硫酸钠 硫酸镁等 特点为安全 简便 分辨率不高有机溶剂沉淀法 常用丙酮和乙醇 特点为分辨率稍高 高浓度溶剂易引起变性等电点沉淀法 蛋白质能保持天然构象和活性 沉淀不完全吸附法 常用硅胶 活性炭 氧化铝等 适用于处理大量样品超滤法 四 纯化 1 离子交换层析2 凝胶过滤原理 根据蛋白质分子大小的不同进行分离介质特点 内部多孔的网状结构常用的凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶优点 分离条件温和 不影响样品的生物活性 样品损失小 回收率高 习题 指出下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱 蛋白质分离范围从5000到400000 时的洗脱顺序 肌红蛋白 16900 过氧化氢酶 247500 细胞色素C 13370 肌球蛋白 524800 胰凝乳蛋白酶原 23240 血清清蛋白 68500 3 疏水作用层析 原理 利用蛋白质表面的非极性基团和介质上的疏水基团间的疏水作用来分离蛋白质的层析方法 介质 以琼脂糖为母体 偶联上非极性基团 如苯基琼脂糖 辛基琼脂糖等 洗脱 高离子强度增加疏水作用 高浓度硫酸铵存在下将蛋白质吸附在介质上 然后逐渐降低硫酸铵的浓度进行洗脱 4 亲和层析 原理 根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的方法 如抗体与抗原 激素与受体 酶与底物 酶与抑制剂等 五 鉴定 1 纯度鉴定 电泳法 HPLC法2 相对分子质量的测定 超离心法 凝胶过滤法 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法3 等电点的测定4 生物活性的测定 巯基乙醇 破坏 S S 电泳过程蛋白质电泳迁移率取决于相对分子质量 与其所带电荷和分子形状无关LogMr a b 样品迁移距离 前沿迁移距离 SDS 变性剂破坏分子中的 H和疏水作用 改变蛋白质的带电状态 改变蛋白质单体分子构象 六 蛋白质含量的测定 总蛋白含量分析 凯氏定氮法 Folin 酚法 Lowry法 双缩脲法 考马斯亮蓝法 紫外吸收法特定蛋白组分的含量分析 酶 激素等测定活性 三聚氰胺 结构用途 广泛应用于木材 塑料 涂料 造纸 纺织 皮革 电气 医药等行业根据美国食物及药物管理局的标准 三聚氰胺可容忍摄入量为每日0 63毫克 公斤体重假蛋白原理 蛋白质主要由氨基酸组成 其含氮量一般不超过30 而三聚氰胺的分子中含氮量为66 左右 通用的蛋白质测试方法 凯氏定氮法 是通过测出含氮量来估算蛋白质含量 因此 添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高
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