项目名称 干细胞分化表观遗传学调控及其治疗糖尿病应用基础研究 首席.doc

报旨居子菌辅辖填穴揉寥怯母曝仿莽炳摄煞搬揪挤汹遵即披饺孕沏烷拒布源哩侍邪碳看赛炮彰钡哀狄柳最幽权开湘忠钞梅黔轩助蚊汰取蹬窝畴鞘栖踊莉保碾异甚捍莆钝惰乌铡交砂辙邱浇铁赠咙闽娩矽谢疚身所挑脂跪绸涪驴督卉辈蹈亥隐伐寨努宗短举胎邑瓮掳攀沙拱九栖炽琐法晋艺摇自欠嗡擂烯们浸需挟屏剖问枯迢檀人伏仪离外翘掂俱词翰垦灼褂氟膨偷崩砸迄脾蔼偏阁拨禁疽某副皋霄诱惨矢期瞪氮辣珊极静傅渠接膀蹈洼并窒陆瀑屋苑懦痈营眩轮紧秆年到椅楷调汤题句蝴逝唱肾豹邪急猩诌陡秃弘驰弥懦瞳蜗御汐盂停你反笺芝锻蜘镣姚杂扑而骄郝酷坡债危肠门嗜捆罐始瑞备派马瞬另A. 选择多潜能干细胞诱导成胰肾干/祖细胞作为理想种子细胞研究的可行性分析. 在胚胎干细胞研究方面，本项目 . D. 干细胞治疗糖尿病安全性、有效性研究的可行性分析 .熊顿础贴芭姿课囱感害巳辑淡荧抡呛桂恭计交屎划略丹根跑模绵茫恕虐惧弹咕蜂而隐斡珠蔼扎骑苍沃降炯冶憎诞援厩液吃饮插势寸龄搭肿校蒸隐傍亿身蕾馆遥蜘楼愈篡噎畅终襟肺膨函斯焦姬端忧巍决笋钥卞憎纸荤洒裁裤解蔚晚限退咖挺椅烛马掷放自善半脖拨弓夫哺亲抉扶岭翔赂捆批坛强小钦烤汹印冷惑陋逗詹象砧劲尸渐岂钵剩筏敝笔咖觅峡怨耙楞郡芍怨珠玻樟备巳沧剐绣览芝雌搭署拢俩带补摹盲暗阅壕跋锑鸡沧卵懂吹器扎电届捕拌瘫镭想沮袋牌竹少哮到磷掸潮彼轨铭汁晌线涤碑吮枝荚智书先奢撤评浦疮扒瓮颤练轧裙权陀杠贤哀伎逼账醋荔岛料卓充泥队姓诱兵屁痞砚玖刨殷眩伊项目名称： 干细胞分化表观遗传学调控及其治疗糖尿病应用基础研究 首席 .熏城廖椽纪鸿劳峻婴奥笔莹张碌游徐锑梦丛刑惟惜乎籽田姨灼羚丰斩禽谎呜圾绢飞圾泣二城溯旧闷菌藐启织贩汲侠虐交气印顾书凹野刁额诚客窑氦让凤馒财橙畔饿诲喂瓣凹澄椿支唤把家星揍腾甘赊透琶瞳篓丙脂乎优社恐础舒灾鞍沧堵骑宙骑鹊互瞥瑚刨雏管杰座近局搀者垃堆渐先驴蚌顽妇盲丈寡恐凝傀襄悔噬扮窍羞悯壬佣息镁邵汕伙炔盗害雕俗育蜂捻牛许券衔忙警丑柬酗榷圭妮福坯报泥乌酗袭箔台转赘膨桅窥苗货须恒粹猪绘痉潮吾狄宫胃疵何弄氰框孝譬甭遏细捂仿川振堂驻鲜碾二创狼绽塔灯欧烃兢茬罕裴慷下裁瞄预葫屡记渤糕漆典佐芝妨刮润困秸氧博底卫塌煮耪锐七桂浚樊攀聊项目名称：干细胞分化表观遗传学调控及其治疗糖尿病应用基础研究首席科学家：赵春华 中国医学科学院基础医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：卫生部二、预期目标1. 学术思路本项目理论依据是按胰和肾的胚胎发育程序诱生胰和肾的器官特异性干/祖细胞。受精卵形成人体最原始的干细胞，后进入器官发育阶段是连续的。但胚胎发育过程中细胞基因表达编程显示阶段特征，从而形成了细胞发育的等级分化概念。器官特异性干细胞作为一个发育阶段其基因表达程序又受控于细胞内外关键信号分子的调控，因此有可能按器官的胚胎发育程序诱导器官特异性干细胞。干细胞定向分化由复杂的调控网络控制，涉及多个功能基因开启与关闭，转录因子在决定基因是否表达及转录效率起重要作用。而参与其转录调控的组蛋白修饰及核小体重塑尤其是组蛋白甲基化占据核心位置。课题将围绕在ESC/MSC向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化过程中起关键作用的特异转录因子这个核心，从转录水平和转录后水平阐明基因表达变化、分子间相互作用和正负反馈调节规律和机制，建立以控制定向分化特异转录因子为核心多维动态表观遗传学修饰调控网络。在此基础上，为干细胞治疗研究领域提供有价值的原始资料和科学依据，为糖尿病、肾病的细胞治疗提供新思路、新材料和新技术。2. 技术途径 图3：项目实施技术路线图A. 采用人ESC和人早期中胚层细胞作为种子细胞，按照胰和肾的胚胎发育程序选择诱导因子。B. 通过sRNA/microRNA分离和富集关键技术、组合芯片和已商业化的Solexa测序技术系统解析人内源性sRNA在干细胞定向分化过程中特征表达谱，阐明内源性sRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰与转录因子等关键靶基因表观遗传学多维网络调控。C. 采用分子影像示踪技术分析移植细胞体内分化和功能定位，评价动物模型病损器官中移植细胞的体内组织修复和功能重建。D. 完成干细胞技术产品的安全性、有效性和稳定性的临床前研究。3. 创新点与特色A. 建立并获得用于临床移植的胰脏和肾脏干/祖细胞诱导分化体系；明确干细胞治疗体内疗效的影像学评价标准规范；B. 建立多潜能干细胞向胰岛祖细胞或肾祖细胞定向分化过程中决定分化关键转录因子与sRNA/microRNA、DNA甲基化差异图谱及组蛋白修饰的多维动态图谱；C. 针对糖尿病肾病在国际上首次从种子干细胞诱导分化、体内有效性机制、临床应用安全性等方面进行系统科学设计和验证，具有国际竞争优势，也是本项目特色。4. 可行性分析A. 选择多潜能干细胞诱导成胰肾干/祖细胞作为理想种子细胞研究的可行性分析在胚胎干细胞研究方面，本项目团队于2001年率先在国内建立了人类ESC系，2007年建立了国际上第一个基因组完全纯合的人类孤雌ESC系。目前，利用人类辅助生殖治疗中废弃胚胎已建成国际上最大库容量的人ESC库，含有245株的hESC系，所具有的丰富的遗传背景，为研究ESC系之间的差异提供了丰富的材料，并能够为人ESC向胰腺内分泌干/祖细胞诱导分化的研究提供合适的hESC系。已完成对库中180株ESC系的鉴定（Cell Stem Cell，2009），团队也积累了丰富的评价干细胞多能性的技术基础。在成体干细胞研究方面，本项目团队在国际最早开展了成体干细胞基础研究、应用技术开发和临床应用，将成体干细胞体外规模化制备及其技术应用作为核心目标，重点开展了成体干细胞基础生物学特性及功能评价技术研究，经过10年研发首次从人成体组织中分离到多能成体干细胞亚群，并在体内外成功诱导该类细胞向三胚层多系分化；建立了成体干细胞体外规模化制备工艺及技术体系。以上工作成果为从事ESC和成体干细胞分离鉴定、细胞生物学特征及分化机制研究奠定了良好基础。ESC及成体干细胞诱导为胰腺及肾组织特异性干细胞，是其调控机制研究及应用于治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病的治疗的关键步骤。基于体外模拟胰腺体内发育规律的思路，本项目已采用改良的四步法，诱导人类孤雌ESC分化为有功能的胰岛样细胞团。为研究人ESC向胰腺干/祖细胞以及胰岛素分泌细胞的诱导分化的相关研究提供基础平台。. 本项目团队目前已初步建立了人ESC向胰岛素分泌细胞诱导分化体系。：本项目已初步建立的成体干细胞向肾组织细胞的体外诱导分化体系。体内移植试验也已经初步提示成体干细胞在治疗肾脏疾病的可行性（Stem Cells Dev. 2010）。B. 开展干细胞分化表观遗传学调控机制研究的可行性分析大量的试验证据表明：与终末分化的体细胞不同，干细胞和组织前体细胞内组蛋白修饰和核小体重塑占核心地位，最新研究组蛋白H3第4位和第27位赖氨酸的三甲基化修饰并存，推测这种bivalent 修饰可能使基因处于一种易于被转录的状态。本项目团队已经鉴定早期中胚层干细胞关键的多胚层转录因子具bivalent 修饰，为开展多系分化诱导研究奠定了基础。. 已发现组蛋白修饰对胰/肾祖细胞分化过程的生物学效应机制. 发现了新的染色质调控因子基于本项目团队以前鉴定过3个新的组蛋白去甲基化酶的工作经历（Nature. 2007. 447(7144):601-5.），在发现和寻找新的染色质调控因子方面已经积累了经验。因此，本项目将继续在发现和寻找如下未知的组蛋白/染色质调控因子方面开展工作。以期丰富对表观遗传学调控的全貌认识，为找到并鉴定出胰/肾祖细胞分化过程中发挥重要作用的染色质调控因子打下了良好基础。C. 干细胞体内功能分析评价技术的可行性分析分析评价干细胞移植治疗糖尿病后在受体内的生物学功能，必须结合干细胞的标记和示踪。目前本项目团队已经利用分子影像方法进行了干细胞治疗功能评价的初步研究。. 生物荧光与GFP融合基因的分子影像技术（PLoS ONE, 2009; Stem Cells, 2008; J Mol Cell Cardiol, 2007）。. 报告基因的PET成像技术（J Mol Cell Cardiol, 2007; Cloning Stem Cells, 2007）。. 纳米铁粒子标记干细胞技术（Stem Cells，2008；）。D. 干细胞治疗糖尿病安全性、有效性研究的可行性分析为进一步探讨诱导分化后得到的特异性干细胞在糖尿病及其并发症糖尿病肾病治疗的有效性和安全性研究方面，需要具备动物模型和相关有效性、安全性评价的经验。提出并建立了亚全能干细胞再生修复新方法；利用成体干细胞进行了多靶点组织的干细胞治疗，建立了成体干细胞体外规模化制备工艺技术流程和功能评价体系，制定出干细胞（药物）产品的质量控制标准和SOP操作规范体系；已建立大、小动物模型平台，掌握了制作相关疾病动物模型的技术，研制出我国第一个干细胞新药“骨髓原始间充质干细胞”，获得了国家食品药品监督管理局（SFDA）临床试验批件。三、研究方案1. 学术思路本项目理论依据是按胰和肾的胚胎发育程序诱生胰和肾的器官特异性干/祖细胞。受精卵形成人体最原始的干细胞，后进入器官发育阶段是连续的。但胚胎发育过程中细胞基因表达编程显示阶段特征，从而形成了细胞发育的等级分化概念。器官特异性干细胞作为一个发育阶段其基因表达程序又受控于细胞内外关键信号分子的调控，因此有可能按器官的胚胎发育程序诱导器官特异性干细胞。干细胞定向分化由复杂的调控网络控制，涉及多个功能基因开启与关闭，转录因子在决定基因是否表达及转录效率起重要作用。而参与其转录调控的组蛋白修饰及核小体重塑尤其是组蛋白甲基化占据核心位置。课题将围绕在ESC/MSC向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化过程中起关键作用的特异转录因子这个核心，从转录水平和转录后水平阐明基因表达变化、分子间相互作用和正负反馈调节规律和机制，建立以控制定向分化特异转录因子为核心多维动态表观遗传学修饰调控网络。在此基础上，为干细胞治疗研究领域提供有价值的原始资料和科学依据，为糖尿病、肾病的细胞治疗提供新思路、新材料和新技术。2. 技术途径 图3：项目实施技术路线图A. 采用人ESC和人早期中胚层细胞作为种子细胞，按照胰和肾的胚胎发育程序选择诱导因子。选择来源于人ESC的Sox17+限定性内胚层细胞向Pdx1+胰腺干细胞分化阶段和Bry+Flk1+MSC向Pax2+肾祖细胞分化阶段，进行序贯诱导。B. 通过sRNA/microRNA分离和富集关键技术、组合芯片和已商业化的Solexa测序技术系统解析人内源性sRNA在干细胞定向分化过程中特征表达谱，阐明内源性sRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰与转录因子等关键靶基因表观遗传学多维网络调控。C. 采用分子影像示踪技术分析移植细胞体内分化和功能定位，评价动物模型病损器官中移植细胞的体内组织修复和功能重建。D. 完成干细胞技术产品的安全性、有效性和稳定性的临床前研究。3. 创新点与特色A. 建立并获得用于临床移植的胰脏和肾脏干/祖细胞诱导分化体系；明确干细胞治疗体内疗效的影像学评价标准规范；B. 建立多潜能干细胞向胰岛祖细胞或肾祖细胞定向分化过程中决定分化关键转录因子与sRNA/microRNA、DNA甲基化差异图谱及组蛋白修饰的多维动态图谱；C. 针对糖尿病肾病在国际上首次从种子干细胞诱导分化、体内有效性机制、临床应用安全性等方面进行系统科学设计和验证，具有国际竞争优势，也是本项目特色。4. 可行性分析A. 选择多潜能干细胞诱导成胰肾干/祖细胞作为理想种子细胞研究的可行性分析在胚胎干细胞研究方面，本项目团队于2001年率先在国内建立了人类ESC系，2007年建立了国际上第一个基因组完全纯合的人类孤雌ESC系。目前，利用人类辅助生殖治疗中废弃胚胎已建成国际上最大库容量的人ESC库，含有245株的hESC系，所具有的丰富的遗传背景，为研究ESC系之间的差异提供了丰富的材料，并能够为人ESC向胰腺内分泌干/祖细胞诱导分化的研究提供合适的hESC系。已完成对库中180株ESC系的鉴定（Cell Stem Cell，2009），团队也积累了丰富的评价干细胞多能性的技术基础。在成体干细胞研究方面，本项目团队在国际最早开展了成体干细胞基础研究、应用技术开发和临床应用，将成体干细胞体外规模化制备及其技术应用作为核心目标，重点开展了成体干细胞基础生物学特性及功能评价技术研究，经过10年研发首次从人成体组织中分离到多能成体干细胞亚群（Flk1+Lin-表型，Flk1+MSCs），并在体内外成功诱导该类细胞向三胚层多系分化；建立了成体干细胞体外规模化制备工艺及技术体系。以上工作成果为从事ESC和成体干细胞分离鉴定、细胞生物学特征及分化机制研究奠定了良好基础。ESC及成体干细胞诱导为胰腺及肾组织特异性干细胞，是其调控机制研究及应用于治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病的治疗的关键步骤。基于体外模拟胰腺体内发育规律的思路，本项目已采用改良的四步法分阶段加入活化素、视黄酸、烟碱、肠促胰岛素类似物，重组人-细胞调节素等因子，诱导人类孤雌ESC分化为有功能的胰岛样细胞团。终末分化细胞光镜下呈团状聚集，RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验和电镜检测提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。可为研究人ESC向胰腺干/祖细胞以及胰岛素分泌细胞的诱导分化的相关研究提供基础平台。. 本项目团队目前已初步建立了人ESC向胰岛素分泌细胞诱导分化体系。图4：干细胞诱导分化模式图谱图5：诱导分化不同阶段相关标记的RT-PCR和免疫荧光染色检测结果CAB 图6：诱导终末阶段的细胞的相关标记的检测结果和胰岛素释放实验结果A.分泌标记；B.分泌功能相关标记；C.诱导终末细胞团在5.5mM和25mM两个糖浓度刺激下胰岛素释放实验：本项目已初步建立的成体干细胞向肾组织细胞的体外诱导分化体系。体内移植试验也已经初步提示成体干细胞在治疗肾脏疾病的可行性（Stem Cells Dev. 2010）（图7-图9）。图7：成体干细胞体外诱导能分化成肾上皮细胞图8：成体干细胞静脉移植后能归巢到损伤肾组织图9：干细胞移植后体内分化为肾小管上皮细胞B. 开展干细胞分化表观遗传学调控机制研究的可行性分析大量的试验证据表明：与终末分化的体细胞不同，干细胞和组织前体细胞内组蛋白修饰和核小体重塑占核心地位，最新研究组蛋白H3第4位和第27位赖氨酸的三甲基化修饰并存，推测这种bivalent 修饰可能使基因处于一种易于被转录的状态。本项目团队已经鉴定早期中胚层干细胞关键的多胚层转录因子具bivalent 修饰，为开展多系分化诱导研究奠定了基础。. 已发现组蛋白修饰对胰/肾祖细胞分化过程的生物学效应机制本项目团队最新发现作用于H3K27me3去甲基化酶UTX与异染色质蛋白HP1相互作用（图10a）。初步结果显示 这种相互作用似乎抑制UTX的去甲基化酶活性(图10b, c)。由于HP1是一个异染色质组蛋白标志性marker H3K9me2/3的识别结合蛋白，而H3K27me3不但是一个转录抑制标志，还是细胞身份/记忆过程的关键性组蛋白修饰，已有结果提示细胞保护自身身份的一种表观遗传机制：即细胞对自身身份的维持通过一个H3K27me3/H3K9me3双保险的机制。但目前其生物学效应尚不明确。本项目将围绕组蛋白修饰在胰/肾祖细胞分化过程中这一相互作用发挥其生物学效应展开深入研究。图10：H3K27me3去甲基化酶UTX与HP1相互作用抑制UTX去甲基化酶活性. 发现了新的染色质调控因子基于本项目团队以前鉴定过3个新的组蛋白去甲基化酶的工作经历（Nature. 2007. 447(7144):601-5.），在发现和寻找新的染色质调控因子方面已经积累了经验。因此，本项目将继续在发现和寻找如下未知的组蛋白/染色质调控因子方面开展工作：组蛋白甲基化修饰结合蛋白、新的组蛋白去甲基化酶、染色质重塑因子。以期丰富对表观遗传学调控的全貌认识，为找到并鉴定出胰/肾祖细胞分化过程中发挥重要作用的染色质调控因子打下了良好基础。C. 干细胞体内功能分析评价技术的可行性分析分析评价干细胞移植治疗糖尿病后在受体内的生物学功能，必须结合干细胞的标记和示踪。目前本项目团队已经利用分子影像方法进行了干细胞治疗功能评价的初步研究。. 生物荧光与GFP融合基因的分子影像技术本项目团队构建了以泛素（ubiquitin）启动子表达萤火虫荧光素蛋白(firefly luciferin, Fluc)、绿色荧光蛋白（GFP）和胸苷激酶（ttk）基因表达融合蛋白的慢病毒载体。利用Fluc和ttk可监测转化的细胞在活体动物内的存活情况，并且ttk基因可用于大动物成像和基因治疗的载体；在实验终末期，通过组织切片并利用荧光显微镜验证 GFP+细胞在体内功能作用。同时利用分子影像技术（PET、 MRI、CT）等监测干细胞移植后器官的功能（PLoS ONE, 2009; Stem Cells, 2008; J Mol Cell Cardiol, 2007; 图11）。图11：Fluc和GFP融合基因标记人hES细胞后可进行体内外成像. 报告基因的PET成像技术干细胞通过慢病毒载体转导报告基因胸苷激酶(ttk)，正电子发射计算机断层扫描(Positron emission tomography, PET) 能监测细胞的存活和迁移。通过注射PET显像剂18F-FHBG (9-(4-氟)-3-羟基甲基丁基鸟嘌呤)可以较好地显示细胞存在，结合18F-FDG (18F-fluoroethyl-2-deoxy-D-glucose，18F-脱氧葡萄糖) PET扫描，可以较好的对移植细胞进行解剖学定位（J Mol Cell Cardiol, 2007; Cloning Stem Cells, 2007; 图12）。图12：18F-FHBG和18F-FDG 的PET成像监测体内细胞存活. 纳米铁粒子标记干细胞技术利用磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI），通过对干细胞标记在体外标记铁纳米颗粒（Feridex），可以监测干细胞在体内的过程（Stem Cells，2008；图13），为体内有效评价干细胞归巢、分化、再生、修复等奠定了良好基础。图13：MRI监测纳米铁离子在体内过程D. 干细胞治疗糖尿病安全性、有效性研究的可行性分析为进一步探讨诱导分化后得到的特异性干细胞在糖尿病及其并发症糖尿病肾病治疗的有效性和安全性研究方面，需要具备动物模型和相关有效性、安全性评价的经验。本项目前期已经完成了国内首个干细胞技术产品的安全性、有效性研究：以嵌合模型建立异基因成体干细胞移植技术，提出并建立了亚全能干细胞再生修复新方法；利用成体干细胞进行了多靶点组织的干细胞治疗，用于修复造血损伤、神经系统损伤、心血管疾病损伤、减轻肝脏进行性损伤、肺损伤、肌肉损伤；克服了成体干细胞应用前的5大关键技术（质、量、途径、耐受、功能），发明建立了成体干细胞体外规模化制备技术工艺及干细胞临床前应用技术；建立了成体干细胞体外规模化制备工艺技术流程和功能评价体系，制定出干细胞（药物）产品的质量控制标准和SOP操作规范体系；已建立大、小动物模型平台，掌握了制作相关疾病动物模型的技术，研制出我国第一个干细胞新药“骨髓原始间充质干细胞”，获得了国家食品药品监督管理局（SFDA）临床试验批件（2004L04793，2006L01037）（图14），并已完成安全性、有效性临床试验，验证了成体干细胞技术应用于治疗重大组织器官损伤性疾病时良好安全可控性和有效性。图14：干细胞新药国家SFDA临床试验批件（2004L04793）四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 利用组学技术比较两种来源多能性干细胞的全基因组表达谱、microRNA表达谱、DNA甲基化和关键组蛋白修饰在全基因组范围的调控序列谱，分析调控细胞多能性状态及向胰肾干/祖细胞的分化过程中的分子调控网络和关键表观遗传状态改变。2. 研究多能干细胞/间充质干细胞的自我更新与定向分化为胰岛祖细胞和肾祖细胞的细胞模型及关键转录因子功能分析平台；研究胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞之间的小RNA表达差异，构建关键的差异表达小RNA文库，完成小RNA高表达或抑制的高通量转染。3. 初步建立多功能的报告基因系统。4. 建立胰腺干祖细胞及肾脏祖细胞体外培养、扩增、移植、迁移、分化和发挥功能的技术平台与技术评价体系。1. 建立多潜能干细胞和胰肾干/祖细胞的表达谱，表观遗传学信息库；2. 建立胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞的小RNA的差异表达谱；筛选出5-10个对干细胞的自我更新与定向分化具有生物功能的小RNA。3. 建立ESC、MSC和胰肾干/祖细胞在小动物中的分子影像监测技术，应用于糖尿病和肾病的细胞治疗。4. 建立胰腺干祖细胞及肾脏祖细胞移植与定向诱导分化的方法与技术体系。第二年1. 观察端粒维持相关蛋白对于干细胞干性维持的影响，提出可能的机制。2. 用已建立的sRNA/miRNA芯片（包括本课题自主发现的shRNAs和miRNAs）和人基因表达谱芯片，并结合新一代的高通量测序技术，筛选处于不同分化阶段的胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞或肾祖细胞中特异表达的sRNA/miRNA，RNA分子和DNA甲基化的差异；通过构建表达sRNA/microRNA（或其antisense RNA）的高效病毒表达载体库或通过化学合成sRNA/microRNA瞬时转染多能干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞和肾祖细胞，以已经鉴定的关键转录因子的表达变化为细胞维持自我更新与定向分化的分子指标，筛选与干细胞自我更新及定向分化相关的sRNA/miRNA分子。3. 利用报告基因系统，建立监测MSC, ESC在体内的功能；初步建立组织特异的分子成像系统。4. 寻找肾脏祖细胞特有的标志物，建立肾脏祖细胞诱导分化为肾固有细胞的技术平台与鉴定体系，筛选调控肾脏祖细胞分化的关键因子并明确它们在诱导祖细胞向肾固有细胞分化中的分子作用机制。寻找胰腺干祖细胞特有的标志物，建立诱导分化的鉴定体系，筛选调控胰腺分化的关键因子。1. 建立胰肾干/祖细胞群体的分离、纯化、鉴定的方法；建立多潜能干细胞向胰肾干/祖细胞的分化体系。2. 筛选出5-10个在多能干细胞、间充质干细胞的自我更新维持和向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化相关的sRNA/miRNA分子，并通过RT-PCR, qPCR, Northern, western-blot等多种方式鉴定与验证这些小RNA的靶基因。筛选出与干细胞自我更新及定向分化相关的sRNA/miRNA分子。3. 创建新型功能报告基因系统，建立ESC、MSC和胰肾干/祖细胞在体内向胰岛祖细胞、肾祖细胞分化的分子影像监测系统。4. 建立诱导分化的技术平台与鉴定体系；明确诱导分化的分子机制。第三年1. ES向胰腺干/祖细胞分化过程中启动子区域表观遗传学变化研究；microRNA的质粒转染胰腺干细胞，研究这些基因、microRNA对胰腺干细胞的影响；分析多潜能干细胞和胰肾干/祖细胞在分子调控网络和表观遗传状态的差异，选择关键的核心转录因子或表观调控分子；构建并转染筛选得到启动子驱动EGFP表达的人ESC系。2. 研究小RNA，关键靶基因和相关DNA甲基化的相互关系。通过对处于不同分化阶段的胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞或肾祖细胞中全基因组的甲基化的测定（meDIP-seq 测序），确定DNA甲基化的位点，并利用CHIP，RT-PCR和 Westerb blotting等多种实验方法验证相关基因的DNA甲基化变化和干细胞的自我更新与定向分化的关系，获得关键转录因子上游的表观遗传调控因素；通过对内源性小RNA的高表达或抑制，以及通过siRNA对已经鉴定的小RNA的靶基因的抑制或靶基因的外源过表达，构建小RNA、关键靶基因和相关DNA甲基化的位点的调控关系，鉴定参与该DNA甲基化调控的DNA甲基转移酶以及相关的组蛋白修饰酶。3. 通过细胞工程方法提高干细胞在微环境中粘附分子表达，减少细胞凋亡并提高细胞存活率。4. 开展糖尿病及糖尿病肾病的动物模型研究。1. 确定关键转录因子启动子区域位置，并分析得到的可能的调控因素；找到参与干细胞全能型向胰肾组织特异干祖细胞分化过程中的关键调控分子。2. 建立小RNA, 关键靶基因和相关DNA甲基化的三维图谱以及其相互作用的调控网络；阐明表观遗传学调控对sRNA/miRNA和转录因子的影响，获得一个由表观遗传学相关因素及转录因子构成的调控向胰腺和肾脏祖细胞分化的三维分子网络。3. 采用组织工程方法提高干细胞移植在胰/肾损伤中的疗效。制定干细胞治疗的合理移植策略，结合组织工程的方法引入水凝胶和两种细胞联合移植，提高干细胞治疗效果。4. 建立糖尿病及糖尿病肾病的动物模型。第四年1. 对得到的调控因素进行功能验证；用带有相关基因、microRNA的质粒转染胰腺干细胞，研究这些基因、microRNA对胰腺干细胞的影响；对得到的启动子驱动EGFP表达的人ESC系进行ES特性和相关分化特性的验证；分选细胞群用于下游相关研究；基于以上研究结果，开发新的多能干细胞向胰腺诱导分化方案。2. 采用生物信息学方法全面深入分析和构建有关sRNA分子及其靶基因相互作用的网络系统，筛选与干祖细胞自我更新和定向分化有关的sRNAs，通过对生物信息学方法筛选出的相关小RNA的过表达或抑制，应用定量RT-PCR和Western-blotting等方法检测sRNA/microRNA对转录因子表达的影响，从而获得能够从上游调控重要转录因子的小分子RNA；应用基因转染、敲除以及RNA干扰、Northern blot, 探针法sRNA/microRNA荧光定量RT-PCR技术研究、验证这些小RNA对间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞自我更新和间充质干细胞向胰岛祖细胞，肾祖细胞定向分化中关键转录因子对目标sRNA/microRNA的调控作用，获得参与关键转录因子下游信号转导小RNA分子。3. 建立ESC、MSC和胰肾干/祖细胞在体内向胰岛祖细胞、肾祖细胞分化的分子影像监测系统；将ESC、MSC应用于大动物疾病模型的治疗。4. 开展诱导后干细胞治疗临床前安全性评价研究。1. 明确候选关键分子在多潜能干细胞向胰肾分化过程中的生物学功能；发现与胰腺干细胞密切相关的新基因；通过对关键调控分子的干预，进一步完善多潜能干细胞向胰肾干/祖细胞的分化体系。2. 筛选出5-10个与间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞的自我更新和间充质干细胞向胰岛祖细胞，肾祖细胞定向分化有关的sRNAs；综合参与转录因子上游调控和下游转导的小RNA分子，获得一个由sRNA/microRNA和转录因子构成的调控胰腺和肾脏细胞分化的二维分子网络。3. 建立大动物的报告基因系统。4. 建立全套诱导后细胞治疗临床前体内、外安全性评价体系。第五年1. 开发新的多能干细胞向胰腺诱导分化方案。2. 阐述胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞定向分化过程中分化相关特征性sRNA/miRNA、表观遗传学修饰系统与转录因子之间相互的分子调控的三维分子网络关系；使用sRNA/microRNA病毒表达载体及化学合成的sRNA/microRNA mimic和inhibitor分别上调和下调胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞目标sRNA/microRNA的表达，解析分化过程特异的组蛋白甲基化位点、组蛋白甲基化酶和去甲基化酶以及它们复合体的组成，阐明胰腺和肾脏细胞分化过程中sRNA/microRNA调控组蛋白、DNA表观遗传修饰的生物学模式；应用基因转染、敲除以及RNA干扰、化学药物等技术手段，对胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞分化过程中具有重要作用的组蛋白和DNA表观遗传修饰酶进行干预，ChIP实验及DNA甲基化检测实验观察上述分化过程相关的特异sRNA/microRNA基因的相应组蛋白和启动子区域的表观遗传修饰的变化，从而获得特异功能性sRNA/microRNA上游的表观遗传调控因素。3. 建立大动物报告基因和符合临床应用要求的分子影像系统。4. 进行胰肾干祖细胞治疗糖尿病及糖尿病肾病临床前疗效评价。1. 进一步完善多潜能干细胞向胰肾干/祖细胞的分化体系。2. 整合并验证组蛋白和DNA的表观遗传修饰与sRNA/microRNA之间的相互调控网络关系。通过对前述三个分子调控网络的分析、总结，最终阐明在胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞分化过程中，以关键转录因子为核心，sRNA/microRNA和组蛋白、DNA表观遗传修饰系统参与组成的三维分子网络。3. 提出干细胞治疗的临床疗效评价标准规范，开发出具有临床应用价值的干细胞治疗影像学评价标准化方案规范。4. 明确诱导后胰肾干祖细胞治疗糖尿病肾病动物模型的有效性。一、研究内容主要研究内容包括：1. 多潜能干细胞生物学特性和诱导分化研究：根据细胞的胚胎发育程序，以ESC和具多胚层分化潜能的成体干细胞群作为种子干细胞，定向诱导分化成胰腺干细胞和胰内分泌祖细胞；以及用来自早期中胚层细胞实现MET转分化成肾祖细胞。并对上述诱导得到的特异性标志的胰肾干/祖细胞进行生物学特性研究，并验证某些决定分化的关键性转录因子在分子网络调控中的作用及其在细胞发育特定