分离毛霉.docVIP

题 目： 环境中分离毛霉 组 员：郑惠婷 郑莎 周理华 邹慧娟班 级： 10生物科学（2）班 指导老师： 黄循吟 何滨 时 间: 第14周第16周 2012年6月毛霉的分离与纯化实验论文作者：郑惠婷 郑莎 周理华 邹慧娟指导老师：黄循吟 何滨 （海南师范大学生物系，海口，571158)摘要：毛霉无匍匐枝及假梗，营养菌丝能渗入琼脂培养基内1.5mm-2.5mm,孢囊跟直接由气生菌丝的豆腐胚上取的。通过制成孢子悬浮液在PAD平板上面做划线分离获取单菌落。经初步鉴定物价更合匍匐菌丝，孢子梗直接由菌丝长出，单生或分枝，初步确定为毛霉，挑去毛霉单个菌落接入PAD斜面培养基，在25摄氏度下培养3天，取出之后观察菌丝和孢子形态。关键词：毛霉； 分离； 鉴定前言：微生物学是迅猛发展的生命科学的重要基础学科，有关微生物的基础知识是现代生命科学及工业应用的重要支柱之一。因此我们在借鉴前人实验的基础上进一步对分离毛霉的实验完善，为了更好了解毛霉形态特征及结构，我们在制作了豆腐乳中获取它，并用单菌落接种于培养基得到纯种毛霉。毛霉在土壤、粪便、禾草及空气等环境中存在，在高温以及通风不良的情况下生长良好。毛霉用途很广，常出现在酒药中。我国多用来做豆腐乳、豆鼓。许多毛霉能产生草酸、乳酸。有的毛霉能产生脂肪酸果胶酶、凝乳霉等。常用的毛霉主要有鲁化毛霉和总状毛霉。毛霉的工业应用：利用其淀粉酶制曲酿酒，利用其蛋白霉以酿制腐乳。实验意义：通过分离毛霉的实验，我们进一步了解，毛霉的形态和构造，学会了毛霉的纯化和分离的方法。通过做这个实验我们将课本上的知识与动手能力相结合，不仅牢固的掌握课本上关于毛霉形态，结构知识，而且我们的动手能力也得到锻炼。关于做实验，我们小组四个人还是很积极，从方案的设计到做实验及实验结果分析与论文，每个人尽自己最大努力出谋划策。做实验不仅是一个人问题而是整个团队合作相互配合，这样一个实验才有可能成功，实验之所以到现在才做完主要是我们没有及时买豆腐使其长霉，总体上说大家很认真很积极。实验流程： 基本过程采样准备无菌实验器材接种培养观察分离纯种镜检实验步骤一、采样1.1采样过程在菜市场买一块豆腐，切成小块，平放在塑料袋中，在上面盖一块布，于在阴暗潮湿的环境中放置3天。目的：使豆腐长出毛霉菌丝，为后续试验做准备二准备无菌试验器材2.1取移液管，培养皿，三角瓶，试管并洗净。用报纸将培养皿，试管，移液管包好，放入烘箱中灭菌目的：为后续的实验做准备原理：高温灭菌原理2.2 配置马铃薯-琼脂培养基目的：配制培养基，为用于接种毛霉单个菌落原理：称取马铃薯-琼脂培养基粉末200克于烧杯中，加水，加热融化至500毫升，分装入三角瓶和试管中。2.3 灭菌：将装好培养基的试管和三角瓶放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟后取出，冷却后储存备用原理：以加热密封锅体内的水和水蒸气的压力来提高锅体内蒸汽温度而达到对物品灭菌的目的注意问题：三角瓶放置时不能贴壁，以免壁上水滴流入培养皿中污染培养基 三接种：3.1 取25g长有白色菌落的豆腐表层于三角瓶中，加入无菌水，用无菌玻璃棒搅拌均匀，边加水边搅拌至250ml。制成霉菌孢子悬液。注意问题：加热时要不断搅拌3.2在无菌操作下用接种环挑取霉菌悬液在马铃薯-琼脂培养基上作划线分离。目的：为获得毛霉单菌落原理：微生物平板划线纯化原理注意问题：严格的无菌操作，防止污染3.3倒平板：将装有培养基的三角瓶放在微波炉中加热至溶化，冷却到50后左右在无菌操作下倒入培养皿。原理：琼脂受热融化，冷却而后凝固四培养：将接种好的培养皿放在恒温培养箱中培养2天。五观察：于长满毛霉的培养皿用镊子或接种针挑取白色菌丝制片观察目的：观察培养皿中霉菌的生长情况，初步确定毛霉菌落，为后面实验分离提供理论依据原理：于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。六分离纯种：在无菌操作下，挑取毛霉菌丝接种与斜面培养基中，于 25下培养3天。目的：纯化毛霉原理：单菌落接种于培养基得到纯种毛霉注意问题：严格的无菌操作，防止污染七镜检：于载玻片上加一滴香柏油，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。目的：再次确认是否为毛霉原理：显微镜的使用原理注意问题：操作要细心注意事项1. 斜面菌种的培养时，温度不可过高，应在30以下，否则菌丝会发生自溶，通常3天即可形成大量孢子。2. 若菌种在冰箱中长期放置后取出，菌体已经溶解，其中会含有细菌，应进行分纯，培养两天后挑菌最好。（以PDA为培养基）3. 毛霉是好氧细菌，扩大培养中，培养基不可装入太多，最好厚度在12厘米，使之有较大的空气接触面积以确保有氧气供给毛霉。灭菌后，基料变实，应将其打散后再接种孢子粉，注意要将培养基和孢子粉充分拌匀搅松。八、实验结果及结果分析 8.1在无任何预处理的情况下，豆腐柸自行腐坏，长出许多微生物，主要为酵母菌和霉菌。 8.2 菌种的分离与纯化结果将长满毛霉的豆腐柸在无菌室用消毒灭菌后的无菌水稀释，样品稀释后在马铃薯葡萄糖培养基上培养，发现马铃薯培养基上主要是霉菌，其中霉菌主要是毛霉、根霉、曲霉；从4个培PDA养基平板中共分离出毛霉菌4株，对其中毛霉进行研究，依次编号为1、2、3、4。其中2号斜面培养基受到污染长满了其他的菌丝，1号和4号培养基毛霉菌丝生长的不明显，可能由于时间太短，或者培养环境不适宜。3号斜面培养基上纯化培养得到单菌落，长满毛霉菌丝，实验分离毛霉得到成功8.3 菌种的形态特征毛霉繁殖迅速，菌落质地疏松，菌丝体呈雪白色、细密、绒毛状、无假根和匍匐枝，孢子囊梗直接由菌丝体生出，孢子圆形、浅褐色。产孢状态，分