现代生物制药技术.ppt

生物制药技术 第二章基因工程制药第三章细胞工程制药第四章酶工程制药第五章动植物细胞培养技术制药第六章生物药物的提取纯化技术 第一章绪论 第一章绪论 第一节生物制药的概念和内容生物制药是指利用生物体或生物过程生产药物的技术 分类 发酵工程制药基因工程制药细胞工程制药酶工程制药 第二节生物药物的性质与分类 生物药物的性质优点 毒性低 副作用小 疗效可靠 特异性特别要提到的是利用重组DNA技术生产的药品 即新生物技术药品 或简称生物新药 劣点 1成分复杂2不稳定 易变性 易失活3易为微生物污染 破坏4生产条件的变化对产品质量影响较大 二生物新药的质量保证 要点 产品的鉴别 纯度 活性 安全性 稳定性和抑制性 鉴定方法电泳方法 免疫学分析方法 受体结合实验 各种高效液相色谱分析法 肽图分析法 EdmanN 末端序列分析法 圆二色谱法 核磁共振法安全性评价无病毒 无菌 无热源 无致敏源致突变 致癌和致畸 三生物药物的分类 1氨基酸类2有机酸 醇酮类3维生素4酶及辅酶类 1 酶类药物 助消化酶类 消炎酶类 心血管疾病治疗酶 抗肿瘤酶 其他酶类 超氧化物歧化酶 SOD PEG 腺苷脱氨酶RNA酶 2 辅酶类药物 ATPNADCoAFAD5脂类 1 磷脂类 2 多价不饱和脂肪酸 PUFA 和前列腺素 3 胆酸类 4 固醇类 5 卟啉类6多肽和蛋白质类人体内的生物活性因子 如激素 免疫球蛋白和细胞生长因子 红细胞生成素 EPO 白细胞介素 2 IL 2 粒细胞集落刺激因子 G CSF 粒 巨噬细胞集落刺激因子 GM CSF 肿瘤坏死因子 TNF 表皮生长因子 EGF 用于伤口愈合 7核酸类及其衍生物 1 核酸类 2 多聚核苷酸 3 核苷 核苷酸及其衍生物8多糖升白 增加白细胞 1 抗生素 2 酶抑制剂 3 免疫调节物质 4 其他生物活性物质 第三节新型生物药物研制的理论和方法 新的化学实体 Newchemicalentity 简称NCE 根据NCE来源将生物药物大致分为两类 一类是利用重组DNA技术二类是利用微生物 动植物或酶生产的非上述药品 通过筛远可获得这类新药的NCE的先导物 新药研究和开发的主要过程 1确定研究计划2准备化合物3药理筛选4化学试验5临床前I期6临床前II期7I期临床8II期临床9III期临床10注册申请上市11售后监测 提供6000 8000个化合物9 13年耗资约2 3亿美元先导化合物的寻找 1筛选模型的确定筛选模型的核心是药物作用靶大规模筛选 High throughputscreening 简称HTS 1 用动物细胞和组织建立的筛选模型LC50 2 酶抑制剂的筛选 3 受体拮抗剂的筛选基因复制 转录因子为对象的治疗 1 转录因子的多样性 2 转录因子具有特异性 3 基因特异性转录因子与人类疾病有关 开始考虑以凋亡为靶治疗 2先导化合物来源一是从化学库或天然产物中筛选二是与受体结合的结构设计 合理新药设计 合理药物设计 Rationaldrugdesign 则是基于受体三维立体结构的认识 通过计算机辅助分子设计全程合成新分子 现今从生物中筛选新药重点放在微生物人们也开始关注植物 动物人类和动物方面 则关注自身免疫系统新药的研究与开发是一个将化学结构研究与生物活性研究连接起来的创造性过程 第四节生物药物的发展历史和概况 生物制药的发展历史李时珍 本草纲目 医生琴纳 Jenner 发明了用牛痘疫苗治疗天花1860年 巴斯德发现细菌 开创了第一次药学革命1928年英国弗莱明发明青霉素至1941年在美国开发成功 从生物体内分离纯化酶制剂的技术日趋成熟 酶类药物得到广泛应用 70年代Zenk应用植物细胞培养生产植物药物50年代提出的DNA双螺旋理论及70年代发展的重组DNA 技术 单克隆抗体技术使生物制药进入一崭新的时代1982年 第一个基因工程药物人胰岛素上市另一重大认识就是认识到生物多样性对生物制药的决定性在基因工程和细胞工程技术方面的研究水平与国外水平相比差距已不大 国内已建立了40多个临床药理试验基地 二生物制药的发展概况1基因工程所依托的基础理论为Watson Crick的DNA模板学说 Monod和Jacob的操纵子学说 1 基因工程药物品种的开发 2 应用基因工程技术建立新药的筛选模型 3 应用基因工程技术改良菌种 4 基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用 5 利用转基因动 植物生产蛋白质类药物 6 基因工程抗体在医药工业中的应用抗体工程细胞工程奠定了细胞培养和细胞融合技术的理论基础 1 单克隆抗体技术生物导弹 2 通过植物细胞培养生产次生代谢产物 3 动物细胞培养三微生物工程微生物工程也称发酵工程所采用的新技术主要应用于3个方面 工艺改进 新药研制和菌种改造 微生物药物 即在微生物生命活动过程中产生的具有生理活性 或称药理活性 的次级代谢产物及其衍生物 有酶抑制剂 免疫调节剂 受体拮抗剂 抗氧化剂 四酶工程 酶工程是酶学与化工技术二者结合的产物第五节生物制药的发展趋势一生物制药中的新技术1大规模筛选的采用与创新大规模筛选是大规模测试化合物的方法 采用机器人自动寻找特殊生物靶 如某个细胞表面受体或一个代谢有关酶的抑制剂 拮抗剂 或激动剂 兴奋剂 的技术 2高效分离纯化系统的采用 1 固相化金属亲和层析 2 超扩散层析 3 灌注层析BioCADworkstation 4 其他快速分离纯化系统AKTAexplorer快速化工工艺开拓系统Streamline扩张柱床吸附技术快速蛋白液相色谱 FPLC Thebiologicalsystem高分辨生物分子纯化而设计的层析系统二Humangenomeproject 简称HGP约10万个gene30亿对碱基 三基因治疗 基因治疗从基因角度可以理解为将外来的基因导入细胞 用正常的基因置换病源基因或补充缺失的基因 从而达到治疗的效果 基因治疗的疾病有三类 致死性遗传性疾病用过去的治疗法很难根治的癌症爱滋病等后天性疾病RNA病毒可望用RNA酶消灭图1 4为用核酸酶 RNA酶 解决的问题 提供更多可供利用的基因设计定向整合的载体 反转录病毒和腺病毒人类将逐渐具备在原子水平解决问题和在基因水平上治疗疾病的能力 四糖链工程糖科学 Glycoscience 和糖链工程即糖生物学蛋白或糖脂类对生态信息的传递起着重要的作用糖类药物 五细胞因子类药物 细胞因子是淋巴细胞来源的淋巴因子或巨噬细胞 单核细胞来源的单核因子 免疫系统中具有各种生物活性的一类因子的总称 对细胞因子的受体结构以及细胞因子糖链部分的结构和功能也做了大量研究 第二章基因工程制药 第一节基因工程制药概述基因工程 Geneengineering 又称重组DNA技术 它能使带有支配各种各样遗传信息基因的DNA片段越过不同生物间特异的细胞壁而组入到完全不同的生物体内 定向的控制 修饰和改变生物体的遗传和变异 人胰岛素 Insulin 具有多种生物功能 维持血糖恒定 增加糖原 脂肪 某些氨基酸和蛋白质的合成 生产方式 一是分别在大肠杆菌中合成A链和B链 再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素 另一种是用分泌型载体表达胰岛素原 2人生长激素人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素 刺激身体生长hGH对一些细胞的增殖和分化以及DNA合成有直接效应 干扰素 Interferon IFN 同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质 其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制 涉及RNA和蛋白质的合成 本身不能直接灭活病毒 而是细胞在干扰素作用后产生出多种抗病毒蛋白 从而阻断病毒的繁殖 分为abt三型基本特性包括种属特异性 作用广谱性和选择性 相对无害性和特殊稳定性 抗细胞内侵害微生物活性 抗细胞分裂活性 调节免疫功能活性 用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病4白细胞介素白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的因子 是一类重要的免疫调节剂 激活并刺激T B淋巴细胞的增殖和分化刺激巨噬细胞和粒细胞的活性 各种细胞的丝裂原治疗恶性肿瘤和病毒性疾病5集落刺激因子是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子 又称造血刺激因子或造血生长因子 分类 粒细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子多能集落刺激因子功能 刺激造血细胞增殖 维系细胞存活 分化定型 刺激终末细胞的功能活性临床多用作癌化疗的辅助药物 6促红细胞生成素肾脏分泌的重要激素与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关能促进红细胞系列的增殖 分化及成熟治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血7肿瘤坏死因子除具有抗肿瘤外 还有抗炎活性 促凝血活性 促进细胞因子分泌 免疫调节作用 抗病毒 细菌和真菌作用 热原质以及参与骨质重吸收淋巴细胞毒素8组织型纤溶酶原激活剂tPA是一种丝氨酸蛋白酶 能激活纤溶酶原生成纤熔酶 纤溶 酶水解血凝块中的纤维蛋白网 导致血栓溶解 主要用于治疗血栓性疾病9心钠素较强的利钠 利尿 扩张血管和降低血压治疗充血性心脏衰竭 高血压 肾功能衰竭 水肿 气喘10重组乙肝疫苗美 法和德国都已研制出人工合成的前S多肽疫苗 具有很强的免疫原性由化学合成的HBsAg多肽与破伤风类毒素偶联形成复合蛋白分子制成的疫苗 第二节基因工程制药中常用的工具酶和克隆载体 一常用工具酶1限制酶它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些独特的性质种类 I型酶II型酶 简单的单功能酶 作用时无需辅助因子或只需Mg2 能识别双链DNA上特异的核苷酸序列 底物作用的专一性强 而且其识别序列与切断序列相一致 限制酶的命名以寄主微生物属名的第一个字母 大写 和种名的前两个字母 小写 写成斜体字的3个字母 缩写 菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面 若同一菌株中有几种不同的限制酶时 则以罗马数字加以区分 例如HindIII限制酶的特性 1 不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列 2 各种限制酶的识别序列都具有回文结构双重旋转对称排列回文结构即正读与反读都相同 3 各种限制酶的切割类型是各式各样的 切后形成各种粘性末端或平整末端 错位切断DNA CohesiveendsFlushends识别序列不同的限制酶 切割后有可能产生相同的粘性末端 同切口限制酶或同裂酶在连接酶的作用下 可以得到嵌合DNA 称为异源二聚体 来源不同的限制酶 其识别序列可以相同 但其切点位置可不同或相同 4 某些限制酶在非标准反应条件下 可能导致酶的识别序列特异性发生改变在非标准条件下 每种限制酶都有上述严格的识别序列导致限制酶的识别序列特异性发生改变 在DNA内产生附加切割 称为限制酶的第2活性 又称为星活性 2DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I 1 5 3 DNA聚合酶活力 2 5 3 外切核酸酶活力降解RNA DNA杂交体的RNA部分 3 3 5 外切核酸酶活力主要功能是校对所合成的链是否能与模板精确无误地配对在一起 切口平移反应 当双链DNA的一条链产生缺口时 DNA聚合酶I将脱氧核苷酸添加到3 羟基末端上 与此同时 其5 3 外切酶从切口的5 磷酸末端切除原有核苷酸 使切口沿着DNA平移 称为切口平移反应 又称为缺口翻译 以放射性脱氧核苷酸置换原来的脱氧核苷酸标记DNA 从而制作DNA探针 大片段即Klenow片段是用枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽链 全酶中去除了5 3 外切核酸酶活力 而聚合酶活力及3 5 外切核酸酶活力均不受影响 补平限制酶切割DNA后产生的3 凹端用 32P dNTP补平3 凹端 对DNA片段进行末端标记在cDNA克隆中 用于合成cDNA第二链应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序T4噬菌体DNA聚合酶与Klenow片段相似的是都具有5 3 聚合酶活力及3 5 外切核酸酶活力 而且3 5 外切酶活力对单链DNA的作用比对双链DNA更强 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶更强的3 5 外切核酸酶活力DNA平均长度比其他聚合酶大得多拷贝长段模板测序酶 测序酶 2 0版 完全丧失了核酸外切酶活力TaqDNA聚合酶及AmpliTaqTMDNA聚合酶水生栖热菌具有5 3 聚合酶活力和依赖于聚合作用的5 3 外切核酸酶活力 最佳作用温度为75 80 C 为避免引物自模板上解离往往需在低于最适温度条件下起始聚合反应 聚合酶链式反应 反转录酶鼠或禽反转录病毒H活力主要用于将mRNA转录成双链cDNA 也可用于制备杂交用探针和标记带5 突出端的DNA片段 DNA连接酶能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶 T4噬菌体DNA聚合酶连接带有匹配粘性末端的双链DNA连接平整末端的双链DNA 大肠杆菌DNA连接酶需NAD辅助因子基因工程中常用的其他酶末端脱氧核苷酸转移酶 简称末端转移酶或TDT酶 作用底物是带3 羟基端的单链DNA或带3 羟基突出端的双链DNA 主要用于给载体或cDNA加上互补的同聚尾以及用32P标记的一种dNTP来标记DNA片段的3 端 T4噬菌体多核苷酸激酶它能催化ATP的 磷酸基转移至去磷酸化的DNA或RNA的5 末端该酶可用于标记DNA5 末端 核酸酶BLA31核酸酶主要活力是3 外切核酸酶活力 DNA内切酶活力反应绝对依赖于钙离子 1 通过可控方式去除双链DNA的末端核苷酸从而缩短DNA分子 2 用于确定DNA小片段的限制酶切图S1核酸酶单链特异性的内切酶可降解单链DNA或RNA 1 去除DNA片段中突出的单链尾部 2 打开从mRNA合成双链cDNA时产生的 发夹环 碱性磷酸酯酶细菌碱性磷酸酯酶 BAP 和牛小肠碱性磷酸酯酶 CIP 两种催化去除单链或双链DNA和RNA分子中的5 磷酸基 脱磷酸作用 去除切割载体DNA两端的5 磷酸基 防止自身环化二常用的克隆载体具有在细胞内进行自我复制的DNA子就是外源DNA片段 基因 的运载体 又可称为分子载体或无性繁殖载体 有了复制子作为外源DNA的载体质粒质粒 Plasmid 是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子 质粒载体的改造和构建特性 1 要有复制子 2 要有能促进外源DNA高水平表达的调控区 如含有强启动子 3 要有多种限制酶的单一切点 4 具有两种以上易被检测的选择性遗传标记 作为对重组与非重组转化体的选择标记 最好有一个具有插入性失活功能 5 质粒载体DNA的分子量要尽可能小 以利于载体容纳较长区段外源DNA片段 6 应属于松弛型复制 7 质粒载体应为非传递性 有较小的宿主范围 不为传递性载体所诱导 阶段 1 将选择标记引入含有pMBI或ColE1复制子的质粒中pBR322仅4 36kb 2 调整质粒载体的结构 提高质粒载体的效率新型载体都引入一个人工合成的由多种常用限制酶单一识别序列组成的多克隆位点或多聚接头 3 引入多种用途的辅助序列 构建具有某些特化功能的质粒载体构建可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体如pUC载体带有一个Lac操纵子的DNA片段 该区段编码b 半乳糖苷酶氨基端的一个片段 该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型b 半乳糖苷酶实现基因内互补 外源DNA插入载体的多克隆位点后 可使酶的氨基端片段失活而破坏这种互补作用 导致带有重组质粒的细菌在含有诱导物IPTG和生色底物X gal培养基上产生白色菌落 从而可用肉眼鉴定重组克隆 构建带有单链噬菌体复制起点的质粒载体可大量获得载体DNA双链中的一条链构建带有噬菌体启动子的质粒载体体外得以转录RNA而翻译构建可对重组克隆进行正选择的质粒载体某些宿主菌致死的基因产物构建含有强启动子的质粒载体常用的几种质粒载体 1 pBR322及其衍生载体非必需区域 分子量相对较大 能被Colk带动转移有关转移的mob区段刚好在非必需区域内 pAT153载体之间缺失2个片段包含结合转移的有关序列pBR327载体 2 pUC系列载体pUC18 pUC19质粒载体pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的rop基因 故这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1或ColE1复制起点的质粒高得多 PUC118 pUC119质粒载体带有M13丝状噬菌体DNA合成的起始 终止及DNA包装进入噬菌体颗粒所必需的序列 这些质粒的宿主细胞被适当的丝状噬菌体感染时 可合成质粒DNA中一条链 并能将此单链DNA包装进入子代噬菌体 pUC的衍生质粒载体噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶转录单位的启动子噬菌体噬菌体载体的构建噬菌体基因组为双链线状DNA感染时 DNA的两末端配对并由连接酶的作用闭合成环状 1 A至J区段 分布在基因组左臂 约占1 3基因组 噬菌体头部 A F 尾部 Z J 2 J至N之间非必需区段 约占1 3基因组控制重组及溶源性的基因 可被消除和取代 3 N至R区段 分布在基因组右臂 与噬菌斑的形成有关 包括调控及免疫性基因 DNA复制基因 转录和裂解基因等 消除多余限制性内切酶位点消除基因组必需区内的酶切位点 保留非必需区内1 2个位点方法 点突变 基因组的置换和缺失去除DNA中一些非必需区段有75 105 38 52kbDNA才能被包装成噬菌体颗粒插入型载体DNA基因组中缺失部分非必需基因 只含有一个可供外源DNA插入的限制性内切酶位点的DNA载体 替换型载体在DNA的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点 酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右双臂分开 有外源DNA代之 携带外源DNA的重组体的正选择标记 提高载体在生物学防护上的安全性 引入了WES三个基因的琥珀突变 这些特性使从实验室环境中逃逸出重组噬菌体的可能性大大降低 Charon16A载体的基因A和B上诱变产生了琥珀突变 结果在含有色原底物Xgal和Lac 指示菌的平板培养基上形成无色的噬菌斑 常用载体 1 Charon系列载体Charon40载体是专门设计用来容纳大片段 2 EMBL系列载体EMBL3 EMBL4对称的两个多酶位点聚合接头序列EMBL3A带有两个琥珀突变 可筛选出SUPF 琥珀抑制基因 相联的DNA序列 构建基因文库 3 gt系列载体为插入型系列载体 包括gt10 pgt11 gt18 23等gt10 专门为在其免疫区 imm434 内单一的EcoRI位点上克隆小的cDNA片段 约6kb 而设计的 阻遏子基因CI CI基因失活形成了重组的CI 噬菌体 噬菌斑为清亮斑 可与非重组的CI 噬菌体所产生的阴暗噬菌斑相区别 gt11 是一个常用的 可用于免疫学筛选的载体 如果插入的DNA片段方向正确且转译读框与LacZ基因一致 则重组噬菌体能在宿主菌内指导b 半乳糖苷酶 含有对温度敏感的阻遏子 43 失活 可作为抗溶源性生长的选择性 M13噬菌体M13噬菌体的基本特性基因组为环状单链DNA分子雄性专一性 即只吸附于带有F质粒的雄性大肠杆菌 F 的性纤毛上而引起感染 转换成双链复制型 RF 在基因3产物的作用下 以单链DNA为模板 先从一个RNA引物开始 通过宿主DNA聚合酶III延伸 合成双链DNA RFDNA 然后在基因2 产物作用下RFDNA进行复制 每个细胞可产生50 100RFDNA拷贝 由基因5产生的M13单链结合蛋白与通过滚环复制合成的DNA单链结合并进行包装形成子代噬菌体 通过细胞壁挤出 并不杀死细胞细胞生长速率降低 并不断释放子代噬菌体继续感染周围细胞在平板上不形成空斑 形成缓慢生长的慢性感染细胞圈M13丝状噬菌体载体的构建将含有大肠杆菌乳糖操纵子调节区段和编码b 半乳糖苷酶基因的头145个密码插入这个区的酶切位点 得M13mp1 可被转译为多肽 多肽虽然没有酶活力 但当M13mp1感染特殊的宿主菌JM103时 会导致多互补而产生有活性的b 半乳糖苷酶 在含有诱导物的培养基上形成蓝色噬菌斑 这两个载体对于具有两个不同酶切位点末端的外源DNA片段 可通过强制克隆而定向连接 常用的M13噬菌体载体M13mp18 M13mp19LacZ区内的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点两个载体不会轻易自身再环化外源DNA在M13mp18 M13mp19中以两个互为相反的方向插入pBR322质粒载体的复制起点 Ori 和氨苄青霉素抗性基因 Ampr 粘粒粘粒是一种有噬菌体粘性末端的杂种质粒 由DNAcos区与质粒DNA重组构建而成 是为克隆和增殖基因组DNA的大片段而设计的和组建真核生物基因文库最大DNA可达52kb 粘粒大小为4 7kb 适宜35 45kbcosDNA序列 将DNA包装到噬菌体颗粒中所必需的序列 携有一个复 制起点 通常是ColE1复制起点 和一个抗药性标记 通常是Ampr 将两个cos位点组合到同一个粘粒载体中 从而大大简化在粘粒载体中的定向克隆 哺乳动物细胞载体系统一类是不带真核复制子的质粒型载体 是在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统 如pTK2 pHyg pRSVneo另一类是带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体 第三节基因工程药物无性繁殖系的组建 目的基因的制取构建基因文库法分离目的基因1用一种或两种限制酶消化噬菌体替换型载体 选用适当方法将载体左 右臂与中间部位的填充片段分离开 2用一种或几种限制酶部分消化高分子量的真核基因组DNA 再用凝胶电泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的DNA 3噬菌体载体臂与真核DNA片段连接成较长的多联体 再利用体外包装系统装入噬菌体头部 成为有感染力的噬菌体 4重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以繁殖 所获得的基因组DNA文库可被长时间利用和贮存酶促合成法制取目的基因平均每个细胞约含10 5g总RNA Mrna总RNA的1 5 从某些特定型别的分化细胞细胞质中 编码某特种蛋白质的目mRNA占总mRNA的50 90 称为高丰度mRNA 低丰度mRNA或稀有mRNA真核细胞的mRNA分子在其3 端均有一多聚腺苷酸 poly A 20 250个 残基组成的尾 可吸附于寡脱氧胸苷酸 Oligo dT 纤维素 构建cDNA文库PT PCR法从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA 1 真核细胞总RNA的分离释放的内源性RNA酶 Rnase 的活力外源性Rnase对RNA制品的污染 硫氰酸胍提取和氯化铯离心法盐酸胍和有机溶剂提取法 2 带poly A 的RNA mRNA的分离纯化与分析常用Northern杂交 RNA印迹法 测定总RNA或poly A RNA样品中特定mRNA分子的大小和丰度 3 cDNA文库的构建cDNA第一链的酶促合成禽源和鼠源反转录酶cDNA第二链的合成自身引导法 杂交体变性而分开后 单链cDNA端能够形成发夹结构而引导E coliDNA聚合酶IKlenow片段酶促合成cDNA第一链 置换合成法 利用cDNA mRNA杂交体为切口平移的模板 由RNA酶H在mRNA链上造成切口和缺口而产生一系列RNA引物 再由DNA聚 合酶I用这些引物以切口平移反应合成cDNA第二链 双链cDNA载体DNA的连接噬菌体体外包装及感染构建cDNA文库目的cDNA克隆的筛选核酸杂交法特异性抗原的免疫学检测法cDNA克隆的同胞选择法RT PCR法合成目的cDNA反转录 聚合酶链式反应从真核生物细胞中提取纯化总RNA在Oligo dT 的引导下 以总RNA中的总mRNA为模板 在反转录酶的作用下 合成总cDNA的第一链 以两个引物所结合的单链cDNA 靶序列 为模板 在Taq聚合酶的作用下进行PCR扩增 合成双链目的cDNA 1 聚合酶链式反应 PCR 体外扩增DNA技术Polymerasechainreaction应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝宏观与微观的联系PCR技术的基本原理 首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链 然后在低温下与两个引物进行退火 使引物与单链DNA配对结合 再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合 延伸 反应 每经过一次变性 退火 延伸三个步骤为一个循环 通过三个温度的不同循环 PCR反应体系的组成a 含靶序列的DNA需用0 2 2g基因组DNAb 寡核苷酸 引物 20 24个核苷酸1mol L尽量选择碱基随机分布的序列GC含量尽可能接近50 避免因较长的互补序列而形成引物二聚体或发夹结构使其5 端带一罕有的限制酶序列 使扩增产物既含有目标序列 两侧又带有限制酶切位点 TaqDNA聚合酶工程酶 AmpliTaqTM 酶量为1 5u d 四种dNTP50 200mol LPCR缓冲液10mmol LTrisHCl pH8 3 于室温 1 5mmol LMgCl2Mg2 为1 5mmol LPCR体外扩增DNA操作过程PCR自动扩增仪 2 PCR扩增由mRNA反转录而成的cDNA 上游 寡核苷酸引物 下游 寡核苷酸引物 DNA体外重组是将目的基因 外源DNA片段 用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上 这种重新组合的DNA称为重组DNA 简称重组体 目的基因DNA与质粒载体DNA的连接定向克隆法当用两种不同的限制酶 如用BamHI和HindIII 消化外源DNA时 可以产生带有非互补突出末端的外源DNA片段 排阻凝胶层析以便与切下来的小片段分开避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点粘性末端连接法质粒载体和外源DNA都可能发生自身环化或形成串联寡聚物用碱性磷酸酶去除线状载体DNA两端的5 磷酸基团以尽量减少载 目的基因与克隆载体的体外重组 体DNA的自身环化或连接 经去磷酸化的载体DNA仍然可有效的与具有5 末端磷酸的外源DNA相连接 产生含有两个切口的环状重组DNA分子 可直接转化并由宿主菌修复切口 这种带切口的环状DNA的转化效率比线状DNA高得多应含有足量的载体DNA平端连接法平整末端连接属于低效反应极高浓度的T4噬菌体DNA连接酶高浓度的平整末端外源DNA和质粒DNA低浓度 0 5mmol L 的ATP不存在亚精胺一类的多胺 适量的凝聚剂快速克隆法需从纯化的凝胶中回收含目的条带的琼脂糖块 熔化后直接进行质粒载体和外源DNA的连接 同聚物加尾法末端转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA3 羟基端的能力 在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物 两者在通过互补同聚物之间氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子 采用GC加尾 即将dC残基加到双链cDNA上 而将互补的dG残基加到用PstI消化的质粒载体上 加合成接头或衔接头法 合成接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体 8 12bp 而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平整末端双链体 第一次反应是使平整末端的双链接头与平整末端的目的DNA相连第二次连接反应则是将加上接头的目的DNA片段与带有匹配粘性末端的载体DNA相连接 衔接头与接头不同 它是一小段带有一个平整末端 与双链DNA连接 和一个粘性末端 与载体的相应末端连接 的双链寡核苷酸 其他转换末端形式连接法 1 部分补平3 凹端 2 完全补平3 凹端 3 除3 突出端 目的基因DNA与噬菌体载体DNA的连接 1 用于构建真核基因组DNA文库 2 用于构建复杂的cDNA文库 3 用于亚克隆在粘性载体中增殖的外源目的DNA序列噬菌体载体臂DNA的制备酶切后将填充片段从载体臂中除去用碱性磷酸酶处理酶切载体片段用双酶切割载体 1 常用蔗糖或氯化钠密度梯度离心法 也有用0 5 琼脂糖凝胶制备电泳纯化载体臂 2 用碱性磷酸酶处理噬菌体臂 末端的5 磷酸基团这样能够有效的防止自身环化 并降低载体左右臂连接以后所形成的非重组载体的数目 用碱性磷酸酶处理之前一定要使噬菌体臂的粘性末端退火并连接 否则将抑制噬菌体多联体的形成 使下一步的包装效率大大降低 3 用双酶消化噬菌体载体噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接一个是载体臂与外源DNA片段的比例另一个是这两种DNA片段在连接反应混合液中的浓度一般都必须进行连接预试验 以检查其效率 以微生物 主要有大肠杆菌 枯草芽孢杆菌和酵母菌 受体细胞是指在转化和转导 感染 中接受外源基因的宿主细胞 1 成感受态细胞 2 应为限制酶缺陷型 3 一般应为DNA重组缺陷型 4 不适于在人体内或在非培养条件下生存 5 它的DNA不易转移 重组载体DNA只在宿主中复制大肠杆菌K12的突变型HB101和C600等作为当前重组DNA的主要受体菌 把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化 将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程称为转染 重组克隆载体引入宿主细胞的转化与感染 重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒 再以此噬菌体为运载体 这一过程称为转导 通常称为感染 重组质粒DNA引入大肠杆菌细胞的转化感受态 细菌吸收转化因子 DNA 的生理状态 细菌在体温下经CaCl2溶液处理 再做短暂加热后 会使受体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态 在此期间他们能够摄取各种不同来源的DNA原生质体化假说和酶受体假说用氯化钙制备新鲜感受态细胞及重组质粒DNA的转化存于 70C 贮存时间过长会在一定程度上影响转化效率 用复合剂制备新鲜或冷冻的感受态细胞及重组质粒DNA的转化二价阳离子 MnCl2和CaCl2 中更长时间 并且用氯化六氨合高钴 DMSO DTT 二硫苏糖醇 等试剂复合处理细菌可提高转化效率 高压电穿孔转化法 电转化法 重组噬菌体DNA的体外包装与感染用噬菌体突变株 参与包装的基因发生突变 感染适当细菌 再从感染细菌中制备包装提取物 用此提取物对完整的噬菌体DNA进行体外包装 包装提取物的制备 1 用两个不同的溶源性菌株制备包装提取物BHB2690菌株 用超声破碎法处理制备含前头部的包装提取物BHB2668菌株 用冻融裂菌法处理 制备含D蛋白和其他必需成分的包装提取物 大肠杆菌C菌株的非抑制性溶源菌SMR10内源性噬菌体DNA的COS位点缺失 不能被A蛋白识别因而不能插入前头部内 而带有COS位点的外源DNA则可被A蛋白识别并被插入前头部 包装过程可继续进行 产生感染性噬菌体颗粒 大肠杆菌C菌株缺少EcoK限制系统 在包装过程中使含有未经修饰的EcoK识别位点的外源DNA免受限制系统作用 重组噬菌体DNA的体外包装与感染 1 用两种不同的提取物进行体外包装和感染 2 用一种提取物进行体外包装和感染重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染磷酸钙共沉淀转染DEAE 葡聚糖介导的转染利用Polybrene的DNA转染利用原生质体融合的DNA转染 2 只用一个溶源性菌株制备包装提取物 电穿孔法DNA转染受体细胞的型别 不同的培养细胞系 其摄取和表达外源DNA的能力相差达几个数量级 1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法重组载体以磷酸钙 DNA共沉淀物形式出现 培养细胞摄取DNA的能力将显著提高 最佳钙离子浓度为125mmol L 最佳DNA浓度为5 30g ml沉淀反应最佳时间为20 30min细胞在沉淀物中的最佳暴露时间为5 42h 2 DEAE 葡聚糖介导转染法这一聚合物可能与DNA结合从而抑制核酸酶的作用 或者与细胞结合从而促进DNA的内吞作用 DEAE 葡聚糖的浓度及细胞暴露于DNA DEAE 葡聚糖混合液的时间是两个大大影响本法效率的重要参数 3 利用Polybrene的DNA转染法 4 利用原生质体融合的DNA转染法用于克隆化目的基因的瞬时表达用于建立稳定转化的哺乳动物细胞系转染效率较高 5 电穿孔法DNA转染受外加电场强度 电泳冲长度 温度 DNA的构象和浓度 培养液的离子成分的影响 含目的基因重组的筛选 鉴定与分析 重组体 菌 的筛选抗生素抗性基因插入失活法用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA时 抗药性基因不在被表达 称为基因插入失活 b 半乳糖苷酶基因插入失活法放射性标记核酸探针杂交筛选法优点 具有高度的特异性和敏感性它不要求插入的外源基因表达先在一种固体支持膜 如硝酸纤维素滤膜 尼龙膜和Whatman541滤纸 上原位裂解待筛选的细菌菌落并使释放出的DNA固定于膜上 然后在溶液中与放射性标记的核酸探针杂交 从而很容易的同时筛选大量菌落 从中找出带有含目的基因重组质粒的菌落 1 切口平移法 2 引物延伸法纯化的DNA与过量的随机引物相混合 煮沸变性 然后用E coliDNA聚合酶I的Klenow片段进行合成 3 体外转录合成RNA探针一种是合成可与克隆于M13噬菌体载体上的序列互补的单链DNA探针另一种是将克隆于特定载体的靶序列转录成RNA探针只需要不含RNA酶的DNA酶I便可容易的除去DNA模板RNA探针与DNA和RNA形成的杂交体更稳定也不会被Rnase消化 可用该酶除去非特异结合的探针 4 cDNA探针的合成一种是用Oligo dT 做引物另一种则采用随机引物 某一特定序列的浓度得以提高 5 合成寡核苷酸探针将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸纤维素滤膜上裂解菌落或噬菌体并使释放的DNA原位结合与滤膜上扣除杂交的方法 制取单链标记cDNA吸收探针 使cDNA探针中固定于滤膜上的细菌DNA或噬菌体DNA与标记探针进行杂交免疫化学筛选法该法的特点是直接检测克隆基因所表达的蛋白质产物 故应用该法时必须事先制备针对该蛋白质或多肽的抗血清或单克隆抗体 而最佳抗体应当是与目的蛋白 抗原 不同表位反应的一组单克隆抗体混合物 或者是不与宿主成分反应的高滴度多克隆抗体 放射化学检测制剂可用抗第一抗体种特异性决定簇的125I标记抗抗体或125I标记金黄色葡萄球菌A蛋白 酶法检测制剂可用与辣根过氧化物酶 HRP 缀合的第二抗体或与碱性磷酸酶 AP 缀合的第二抗体形成不溶性有色沉淀 重组体的鉴定凝胶电泳鉴定法标准方法直接用溴化乙锭进行染色以确定DNA在凝胶中的位置 并直接与紫外灯下观察DNA条带 应有两条带 一条是泳动速度较慢分子量较大的带 相当于质粒载体DNA 另一条是泳动速度较快分子量较小的带 相当于目的基因DNA片段 平板裂解物法和液体培养法Southern转移杂交法 1 琼脂糖凝胶电泳分离重组DNA的限制酶切片段 2 将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持体上硝酸纤维素滤膜或尼龙膜毛细管转移法真空转移法 3 放射性标记探针与固着于膜上的DNA杂交基因产物鉴定法常用体外转译法对基因产物进行鉴定 从细胞中提取的天然mRNA或通过克隆化的DNA在体外转录产生的mRNA 在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质 这些体外翻译反应产物可通过免疫沉淀或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分析鉴定 对原核生物的基因产物进行鉴定 常用大肠杆菌或枯草芽 胞苷菌无细胞系统 而对真核生物基因产物常用兔网织红细胞裂解液或麦胚提取物重组DNA的序列分析一种是Sanger双脱氧链终止法 酶法 测序另一种是Maxam GilbertDNA化学降解法测序1Sanger双脱氧链终止法DNA测序的主要试剂 1 模板 2 通用引物 3 DNA聚合酶I的Klenow段 反转录酶 TaqDNA聚合酶 测序酶 测序酶2 0版 4 采用 32S dATP 5 采用诸如dITP或7 脱氮 dGTP Sanger双脱氧链终止法测序过程一是退火反应 即寡核苷酸引物与模板DNA杂交二是4组链延伸 链终止反应96孔U形孔微量滴定板中进行测序仪 PE公司推出的ABIPRISM310型全自动DNA测序仪310型测序仪采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺凝胶平板电泳进行DNA测序分析 不仅具有DNA测序 PCR片段大小分析和定量分析功能 而且实现了全部操作自动化 包括自动灌胶 自动进样 自动数据收集分析 377型测序仪采用四种荧光染料标记 激光检测的方法 五目的基因在宿主细胞中的表达 基因表达在原核生物和真核生物中是有区别的 在原核生物中基因表达是以操纵子形式进行 砖录是在核内进行 先生成hnRNA 再加工去掉内含子 修饰5 和3 末端才形成mRNA 而mRNA只能在细胞浆的核糖体中转译成多肽或蛋白质 再经加工 糖化 形成高级结构 原核细胞 主要是大肠杆菌 真核细胞表达体系 如酵母与哺乳动物细胞系目的基因在原核细胞中的表达在大肠杆菌中表达合成完整天然蛋白在细菌中表达原核蛋白时 首先必须选择带有可调控的强原核启动子的表达载体 噬菌体PL启动子 tac启动子和T7噬菌体10启动子从外部同时提供启动子和有效的核糖体结合位点 起始密码子 ATG 和Shine D algarno序列 后者简称SD序列mRNA上的SD序列与16SrRNA上的3 端序列之间形成碱基配对 由此带动核糖体与mRNA的结合 一种是可使克隆化目的基因表达为融合蛋白的一部分融合蛋白由位于其氨基端的原核蛋白 能被蛋白酶或溴化氰裂解的序列以及目的蛋白三部分组成 融合蛋白通常较稳定 易于鉴定并可用作抗原 也可产生不含氨基端甲硫氨酸的蛋白高效表达由双分子胰岛素原组成另一种是外源蛋白的分泌型表达系统融合到编码信号肽的DNA中而实现的可使蛋白质按适当方式折叠通常产量不高 克隆化目的基因表达水平的提高与检测RNA不稳定 过早终止 无效翻译及蛋白质不稳定蛋白质缺陷型菌株在培养和收获细胞期间使用蛋白酶抑制剂通过提高目的蛋白的合成量加以克服 1 运用定点诱变技术使核糖体结合位点 SD序列和起始密码子ATG 周围的碱基对发生突变 2 试用不同表达水平的大肠杆菌宿主菌株 如利用转录终止缺陷型菌株或RNA代谢突变株 可提高功能性RNA的合成量 3 在目的基因DNA的下游装置一段DNA序列 4 通过改变温度 核糖体结合位点 启动子强度 质粒拷贝数或诱导物的量 目的基因在真核细胞中的表达原核细胞对真核生物活性蛋白不能进行有效的翻译后加工包括二硫键形成 糖基化 磷酸化 寡聚体形成 特异性蛋白裂解真核蛋白比活力都很低 与蛋白质的折叠方式不正确或折叠效率低有关真核细胞 如哺乳动物细胞 表达系统可以分为两类 一类是采用病毒载体的表达系统另一类是转染DNA的表达系统克隆化的目的基因必须插入适当的表达载体并在细菌中克隆和复制扩增后才转染哺乳动物细胞 用于在哺乳动物细胞中导入和表达克隆化目的基因的质粒载体经过改造后既带有与待表达基因序列5 端和3 端相匹配的限制酶切位点 又带有具备所需特异性的调控序列元件 复制子 抗生素抗性基因 单一限制酶切位点 1 启动子与增强子根据用于表达重组基因的细胞型别来决定TATA25 30bp引导RNA聚合酶II在正确位点上起始RNA的合成100 200bp决定转录起始的速率SV40早期基因增强子 2 加poly A 信号一种是位于poly A 位点下游的GU丰富区或U丰富区另一种是位于poly A 位点上游11 30个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA 3 剪接信号在一级转录物上加上poly A 后通过剪接除去内含子并产生成熟的mRNA 然后在从细胞核转运到细胞质 内含子最前面 GU 和最后面 AG 的两个核苷酸总是保持不变剪接点之间的距离和周围的DNA序列 包括剪接点侧翼的外显子序列的改变 显著影响mRNA前体的剪接历程和剪接点的使用效率 4 用于复制和选择的元件病毒复制子表达转染目的基因的重组细胞必须通过在同一细胞中引入另一种选择标记基因才能得以识别分离 将编码目的蛋白的目的基因 在一个质粒上 和编码选择标记蛋白的基因用共转染方法同时导入哺乳动物细胞 六基因工程药物无性繁殖系的组建实例 人胰岛素原融合蛋白重组菌株的组建重组表达质粒pJG202的构建与鉴定重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达人a2b型干扰素 hIFN a2b 工程菌株的组建双SD顺序hIFN a2b基因的获得重组表达质粒pMZI2B的构建人a2b型干扰素工程菌株的形成与基因的表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌株的组建RT PCR法制备GM CSFcDNAGM CSF重组表达载体与工程菌株的组建 乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建HBsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建这个质粒在乳酸克鲁维酵母及大肠杆菌中都能复制XbaISalI插入片段的方向通过电泳检查XbaI和SalI双酶切片段的大小来确定2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达人组织型纤溶酶原激活剂组合突变株CHO细胞株的组建真核表达质粒pLFrGGI的构建FrGGISV40EAdMLPSV40P采用二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂氨甲喋呤 MTX 选择加压共扩增外源基因 2高效表达FrGGI tPA突变体 的CHO细胞株的获得 红细胞生成素中国仓鼠卵巢细胞株的组建质粒与细胞株EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建重组表达质粒转染COS 7细胞及产物表达重组表达质粒转染CHO dhfr 细胞及EPO表达氨甲喋呤 MTX 可以控制人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建含hTNF a基因的重组质粒的构建共转染与重组病毒的获得重组病毒感染Sf21细胞及hTNF a的表达 第四节基因工程药物的生产 基因工程菌株 细胞 的培养与发酵宿主 载体和克隆基因环境条件工程细菌的培养与发酵 1 发酵用工程菌株的筛选 2 发酵培养基的选用 3 接种量对发酵的影响 4 溶解氧 DO 水平对发酵的影响 5 pH对工程菌株生长和表达的影响前期培养阶段着重于优化工程菌株的最佳生长条件后期培养阶段着重于优化外源蛋白的表达条件 6 热诱导时机对产物表达量的影响一般在菌体对数生长期或对数生长后期进行生温诱导表达分批发酵培养 7 热诱导的升温时间对发酵的影响 8 高密度对发酵的影响单纯追求高密度发酵的结果是徒然的没有明显的蛋白产物条带 发酵产物没有生产应用价值工程酵母的培养与发酵基因工程乙肝疫苗通常可使用三种表达系统 即酵母系统 哺乳动物细胞系统及疫苗病毒载体系统 1 乙肝基因工程酵母细胞重组质粒由三部分组成穿梭质粒 2 工程酵母菌株的制备与培养 3 工程酵母的发酵工程细胞的培养与发酵 1 工程细胞株 2 工程细胞的扩增培养 3 生物反应器的细胞培养与rhEPO的生产填充床生物反应器基因工程药物的分离纯化基因工程药物分离纯化的费用占整个生产费用的80 90 特点 1 产物大多数处于细胞内 提取前需将细胞破碎 2 产物浓度较低 杂质多 而最后成品要求达到的纯度高 3 产物都是大分子蛋白质 通常不稳定 遇热 极端pH 有机 溶剂和剪切力等易引起失活 影响基因工程产物分离纯化工艺设计的主要因素产物活性 纯度和杂质首先应建立基因工程产物活性 纯度及可能含有杂质的有效检测方法SDS PAGE HPLC 毛细管电泳 等电点聚焦 肽谱分析和氨基酸分析产物表达形式和表达水平真菌和动植物细胞一般以分泌的形式表达特点 其表达基因产物的形式有胞内不溶性表达 包涵体 胞内可溶性表达 细胞周质表达等多种产物本身的分子特性产物的用途和需求量体外诊断试剂纯度在80 以上 体内治疗产品应达到98 以上 各种产物表达形式采用的分离纯化方法细胞内不溶性表达产物 包涵体高产量使某些目的蛋白质以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物 包涵体 1 菌体细胞的收集与破碎物理 化学和酶学三种方法超声波破碎 高压匀浆和加沙研磨碱和表面活性剂 2 包涵体的分离 洗涤与溶解离心法低浓度弱变性剂 如尿素 表面活性剂 如TritonX 100 硫酸链霉素沉淀和酚抽提 溶解包涵体打断蛋白质分子内和分子间的非共价键 离子键和疏水作用溶解包涵体的试剂包括尿素 烟酸胍 SDS 碱性溶剂和有机溶剂还有一种用离子交换树脂溶解包涵体的方法 3 变性蛋白质的纯化柱层析 凝胶过滤 离子交换层析和高效液相色谱 HPLC 4 重组蛋白质的复性分泌型表达产物浓缩的方法包括沉淀和超滤沉淀包括中性盐 有机溶剂和高分子聚合物等方法截留不同分子量的膜供应3大肠杆菌细胞内可溶性表达产物