重组DNA技术.doc

复习：回忆以下概念克隆、重组DNA技术、限制性核酸内切酶、回文结构、目的基因、克隆载体、质粒、噬菌体新授：一、重组DNA基本原理述：一个完整的DNA克隆过程包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞，就可以获得大量该基因编码的相应产物。（课本P117，图910）（一） 目的基因的获取述：利用重组DNA技术构建嵌合DNA时，欲插入载体DNA的外源DNA片段中即含有我们感兴趣的基因或DNA序列目的基因。目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源： 1. 化学合成法述：如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列后，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。2细胞提取（基因组DNA）步骤：提取基因组DNA限制性核酸内切酶切DNA片段（含感性趣的基因） 片段分别与克隆载体重组分别转入不同受体菌扩增（存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库，G文库）筛选含感兴趣基因的菌落扩增回收感性趣的基因。3cDNA文库（幻灯59、60）述：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA (cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受菌体，扩增为cDNA文库，然后再采用适当方法从cDNA文库种筛选出目的cDNA。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包括了细胞全部mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。步骤：提取mRNA 逆转录合成cDNA 与载体重组，转入菌体 cDNA文库 筛选含感性趣基因的菌落扩增回收感性趣的基因。4DNA扩增述：如知道了目的基因5与3端的核苷酸序列，可设计合适的引物，在具备其他相关条件下，采用聚合酶链反应扩增特异性目的基因。（二） 克隆载体的选择与改建述：外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连接到复制子上，外源DNA则可做为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一项极富技术性的专门工作，根据不同的目的、操作基因的性质，选择和构建相应的载体。一般常用破碎细菌、密度梯度离心等方法来取得纯化的载体DNA。 良好的克隆载体应具备的条件：（课本P118）（三） 目的基因与载体的连接述：通过不同途径获取含目的基因的外源DNA、选择或改建适当的克隆载体后，下一步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA连接酶将外源DNA与载体共价连接的。但在连接前，首先需要对目的基因和载体进行分离、剪切，为构建重组DNA分子作准备，这些过程涉及到一系列酶的催化反应，酶是重组DNA技术必不可少的工具。1 选择合适的限制酶从DNA链上切割所需的目的基因，使分离所得的基因具有黏性末端2使用同种限制酶切割质粒DNA，使其切口具有与目的基因相同互补的黏性末端3在一定条件下，将目的基因与载体用DNA连接酶连接起来，构成DNA重组体。（四）重组DNA导入受体菌1外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子后，需将其导入受体菌。随着受体菌的生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖2筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆3选择适当的受体菌（安全在人肠道无存活或存活率极低，应为限制酶和重组酶缺陷型。如E.coli K12的改造菌），然后经特殊方法处理，使之成感受态细胞，即具备接受外源DNA的能力。4根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。（五）重组体的筛选述：通过转化、转染或感染，重组体DNA分子被导入受体细胞， 经适当涂布的培养板培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。由于每一重组体只携带某一段外源基因，而转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，如何将众多的转化菌落或转染噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程称筛选或选择。述：根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法或非直接选择法。1 直接选择法针对载体携带有某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。抗药性标志选择：抗药性标志基因如ampr、terr、kanr等。转化后含抗药性标志基因的转化子细菌可在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落。目的基因插入抗药性标志基因，该基因失活，不能在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落，通过有、无该抗生素对比培养，区分单纯载体或重组载体的转化菌落。标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，即可利用营养突变菌株筛选，此即标志补救。2 分子杂交法利用32P标记的探针与移至硝酸纤维素薄膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择鉴定目的基因。（幻灯7678） 原位杂交（幻灯8081）3免疫学方法利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行的间接筛选法。其特异性强，灵敏度高，尤其适合筛选不为宿主菌提供任何选择标志的基因。（六）克隆基因的表达述：克隆基因（cDNA或基因组DNA）在受体细胞进行转录、翻译、翻译后加工，产生有用蛋白质的的过程。 克隆基因进行正确大量表达有特殊意义的蛋白质称蛋白质表达。 不同的表达体系，目的基因来源与性质、表达载体的构建、受体细胞的建立、转化及表达产物的分离纯化等技术和策略不同。例：原核表达体系E.coli是最常用的原核表达体系 优点：培养方法简单、迅速、经济； 适合大规模生产工艺； 运用E.coli表达外源基因有20多年的经验 表达载体的符合标准：幻灯84 实际应用中存在的不足之处：幻灯86三、重组DNA技术与医学的关系述：重组DNA技术与医学实践相结合的结果导致了分子医学的诞生和发展。分子医学包含的领域及内容如下：（一)疾病基因的发现 述：根据基因定位克隆一个基因。根据克隆基因的定位和性质研究所提供的线索，可进一步确定克隆的基因在分子遗传病中的作用。对于新的遗传病的发现、遗传病的诊断和治疗都是极有价值的。人类基因组计划就是对人类全部基因组进行制图或定位，并掌握其全部序列信息，人类则完全可能通过对候选基因的控制和改造，从根本上治疗和防止遗传病的发生和流行这一设想而提出的。(二)发展生物制药 述：利用重组DNA技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业。重组蛋白质药物生产是在功能研究、基因克隆基础上，构建适当的表达体系表达有生物活性的蛋白质、多肽；再经过科学的动物实验、严格的临床试验和药物审查，发展为新药物。 (三)基因诊断述：基因诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传性疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断。 DNA诊断的基本过程：分离、扩增待测DNA片段利用适当分析手段，区分或鉴定DNA的异常。 按现代遗传病诊断标准，一种可靠的DNA诊断学方法必须符合： 能正确扩增靶基因； 能准确区分单个碱基的差别；本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定；便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。 (四)基因治疗述：所谓基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因缺焰，从而达到治疗的目的。 针对体细胞进行基因改良的基因治疗称体细胞基因治疗，这类基因治疗仅单独治疗受累组织，类似于器官移植。 性细胞基因治疗因对后代遗传性状有影响，目前仅限于动物实验(转基因动物)，以测试各种重组DNA在矫正遗传病方面是否有效 。(五)基因预防遗传病的预防 1产前诊断 ：述：通过胎儿组织活检、羊膜腔穿刺（幻灯100）、羊膜绒毛样品及母体血循环中的胎儿细胞进行。 从安全角度考虑，无疑通过母体血循环中的胎儿细胞进行是最值得提倡的。（幻灯101）2携带者测试 基因测试常用于检出隐性遗传病携带者，包括隐性遗传病受累个体家庭的其他成员和有特殊遗传病死亡家庭中的危险人群。 携带者测试的意义：囊性纤维变性是白种人儿童中最常流行的常染色体隐性遗传病，发病率为12500；携带者普查阳性的夫妇生育受累儿童的危险性为14；双亲阴性者为1109 200；若配偶一方为阳性、另一方为阴性，其危险性为1661。由此可见，如果能建立可行的携带者测试方法，并能检出其绝大多数携带者，这对指导婚姻和生育是很有价值的。3症候前诊断 述：对于某些单基因紊乱所引起的综合征，仅至晚年才会有明显表现，如成年多囊性肾病和Huntington病。由于对某些成年发病有关基因已有所掌握，故而在综合征发生前可能作出预测，协助他们作生活方