血红蛋白的提取与分离PPT课件.ppt

1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 1 1 凝胶 2 凝胶色谱法的原理 分子筛效应 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢 而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离 依据的特性是 蛋白质分子量的大小 分配色谱法 2 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙 路程短 流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部 路程长 流动慢 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离 依据的特性是 蛋白质分子量的大小 3 4 4 凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 5 洗脱 从色谱柱上端不断注入缓冲液 促使蛋白质分子的差速流动 6 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 2 作用 能够抵制 的对溶液的 的影响 维持PH基本不变 外界的酸或碱 PH值 7 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 使用比例 在不同PH范围内 思考 说出人体血液中缓冲液 NaH2PO4 Na2HPO4 H2CO3 NaHCO3 8 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液 目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色 和材料的科学研究 活性 9 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的PH 电泳 指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 10 11 课题3血红蛋白的提取与分离 I 影响蛋白质分子运动速度的因素 12 分类 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 测定 通常用十二烷基硫酸钠 SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 表面活性剂 13 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 SDS能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物 SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素 SDS 单条肽链的分子量 分子的大小 14 血红蛋白的提取与分离 二 实验操作 实验步骤 录像 15 血液组成成分 阅读思考 血液由 和 两部分组成 血细胞中 细胞数量最多 细胞的含量最高的化合物是 该化合物是由 和 构成的 其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团 课题3血红蛋白的提取与分离 II 16 四 血红蛋白 在红细胞的组成中 约90 是血红蛋白 它由四个肽链组成 包括两个 肽链和两个 肽链 每条肽链环绕一个亚铁血红素基团 可携带一分子氧或一分子二氧化碳 血红蛋白因含血红素而呈现红色 17 二 实验操作 1 样品处理 一 蛋白质提取和分离步骤 二 操作过程 本课题可选用猪 牛 羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白 1 红细胞的洗涤 洗涤目的 去除杂蛋白 以利于后续血红蛋白的分离纯化 洗涤次数不可过少 洗涤操作 1 采集血样 2 低速短时间离心 速度越高和时间越长 会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀 达不到分离的效果 3 吸取血浆 上层透明的黄色血浆 4 生理盐水洗涤 用五倍体积的质量分数为0 9 的氯化钠溶液洗涤 5 低速离心 低速短时间 6 重复4 5步骤三次 直至上清液中已没有黄色 表明洗涤干净 18 1 洗涤红细胞 洗涤过程 血液100mL 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 19 2 释放血红蛋白 阅读思考 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了哪些物质 为了加速释放过程 采取了什么措施 目的分析 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 课题3血红蛋白的提取与分离 II 20 2019 12 31 21 2 血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积 再加40 体积的甲苯 置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 二 实验操作 22 3 分离血红蛋白溶液 过程 将搅拌好混合液转移到离心管内 以2000r min的速度离心10min 试管中溶液层次 第1层 最上层 甲苯层 无色透明 第2层 中上层 脂溶性物质沉淀层 白色薄层固体 第3层 中下层 血红蛋白的水溶液层 红色透明液体 第4层 最下层 杂质沉淀层 暗红色 分离 用滤纸过滤 除去脂溶性沉淀层 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 23 3 分离血红蛋白 分离过程 红细胞混合液 课题3血红蛋白的提取与分离 II 24 4 透析血红蛋白 25 透析过程动画演示 26 纯化 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 3 样品的加入和洗脱 凝胶色谱法 分配色谱法 录像 27 28 观察你处理的血液样品离心后是否分层 见教科书图5 18 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的提取纯度 三 实验结果分析与评价 1 你是否完成了对血液样品的处理 你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗 2 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生 你的色谱柱装填得成功吗 你是如何判断的 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯 检查凝胶是否装填得均匀 此外 还可以加入大分子的有色物质 例如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 观察色带移动的情况 如果色带均匀 狭窄 平整 说明凝胶色谱柱的性能良好 如果色谱柱出现纹路或是气泡 轻轻敲打柱体以消除气泡 消除不了时要重新装柱 29 如果凝胶色谱柱装填得很成功 分离操作也正确的话 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 如果红色区带歪曲 散乱 变宽 说明分离的效果不好 这与凝胶色谱柱的装填有关 3 你能观察到蛋白质的分离过程中 红色区带的移动吗 请描述红色区带的移动情况 并据此判断分离效果 三 实验结果分析与评价 30 思考4人们用鸡的红细胞提取DNA 用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么 鸡的红细胞具有细胞核 含有DNA 便于进行DNA的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 31 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 插到玻璃管的一端 注意事项 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否则难以铺实尼龙网 还会导致液体残留 蛋白质分离不彻底 顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 安装其他附属结构 32 2 凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择 A 材料 交联葡聚糖凝胶 G 75 B 代表意义 G 表示凝胶的交联程度 膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值 即每克凝胶膨胀时吸水7 5克 凝胶的前处理 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后 配成凝胶悬浮液 沸水浴法时间短 还能除去微生物和气泡 凝胶色谱柱的装填方法 A 固定 将色谱柱装置固定在支架上 B 装填 将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶填装紧密均匀 注意 装填凝胶柱时不得有气泡存在 如果凝胶装填得不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形成无效的空隙 搅乱蛋白质的洗脱次序 影响分离的效果 33 P70你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密 均匀吗 答 凝胶实际上是一些微小的多孔球体 小球体内部有许多贯穿的通道 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部 只能分布在颗粒之间 通过的路程较短 移动速度较快 相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道 通过的路程较长 移动速度较慢 因此 样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出 相对分子质量中等的分子后流出 相对分子质量最小的分子最后流出 从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离 如果凝胶装填得不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形成无效的空隙 使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过 搅乱洗脱液的流动次序 影响分离的效果 34 35 洗涤平衡 装填完毕后 立即用缓冲液洗脱瓶 在50cm高的操作压下 用300ml的20mmol l的磷酸缓冲液 pH为7 0 充分洗涤平衡12小时 注意 1 液面不要低于凝胶表面 否则可能有气泡混入 影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 2 不能发生洗脱液流干 露出凝胶颗粒的现象 2 凝胶色谱柱的装填 50cm高 36 3 样品加入与洗脱 调节缓冲液面 打开下端出口 使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 滴加透析样品 吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端 滴加样品时 吸管管口贴着管壁环绕移动加样 同时注意不要破坏凝胶面 样品渗入凝胶床 加样后打开下端出口 使样品渗入凝胶床内 等样品完全进入凝胶层后 关闭下端出口 洗脱 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸缓冲液到适当高度 连接缓冲液洗脱瓶 打开下端出口进行洗脱 收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5ml收集一试管 连续收集 在分离过程中 如果红色区带均匀一致的移动 说明色谱柱制作成功 注意 正确的加样操作 1 不要触及并破坏凝胶面 2 贴壁加样 3 使吸管管口沿管壁环绕移动 37 3 样品加入与洗脱 注意 正确的加样