基因工程步骤.ppt

一 学习目标简述基因工程原理及基本操作过程二 学习重点和难点1 基因工程基本操作程序的四个步骤 重点 2 从基因文库中获取目的基因 难点 3 利用PCR技术扩增目的基因 难点 1 2基因工程的基本操作程序 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区下游 调控遗传信息的表达 调控序列 外显子 能编码蛋白质 内含子 不能编码蛋白质 启动子 终止子 转录 mRNA前体 成熟mRNA 切除内含子转录部分 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 能转录相应的信使RNA 能编码蛋白质 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 一 目的基因的获取 用3分钟阅读P8 11 并思考下列问题 然后用2分钟与同桌交流 讨论 1 获取目的基因的常用方法有哪些 2 何谓基因文库 其类型有哪几种 3 如何构建基因文库 4 何谓PCR技术 其原理 条件和过程是怎样的 一 目的基因的获取 1 目的基因 主要指的是编码蛋白质的结构基因 也可以是一些具有调控作用的因子 2 获取方法 1 从基因文库中获取目的基因 2 利用PCR技术扩增目的基因 3 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 3 基因文库又称DNA文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 所有受体菌的集合即为该生物的基因文库 基因文库由外源DNA片段 载体和宿主组成 按外源DNA片段的来源分基因文库分为 基因组DNA文库 包含了某物种的所有的基因部分基因文库 只包含了部分基因文库 如cDNA文库 1 载体DNA片段的制备DNA分离纯化 限制酶切2 供体DNA片段的制备总DNA分离纯化 酶切法 分离特定大小DNA片段 3 载体与基因组DNA片段的连接 4 重组DNA转化受体细胞 4 基因文库的构建 基因组文库的构建 通过对受体菌的培养而储存基因 cDNA文库的构建 反转录法 目的基因的mRNA 单链DNA 反转录酶 DNA聚合酶 双链DNA 目的基因 接到载体 基因组文库和部分基因文库的比较 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 思考 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因 根据基因的有关信息如根据基因的转录产物mRNA 基因的核苷酸序列 基因翻译产物蛋白质等来获取目的基因 2 利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应 PCR 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA双链复制 已知基因的核苷酸序列 前提条件 四种脱氧核苷酸 成对引物 DNA聚合酶 Taq酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR的基本反应步骤 变性90 95 C 延伸70 75 C 退火55 60 C PCR总结 3 化学方法人工合成目的基因 基因比较小 已知核苷酸序列 直接利用DNA合成仪用化学方法合成 不需要模板 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 基因的核苷酸序列 目的基因 从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成 归纳 获取目的基因的方法 二 基因表达载体的构建 核心 质粒 DNA分子 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种限制酶 目的基因与运载体的结合过程 实际上是不同来源的基因重组的过程 1 基因表达载体的构建方法 2 基因表达载体的目的 1 使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代 2 使目的基因能够表达和发挥作用 3 基因表达载体的组成 思考 它们有什么作用 表达载体为什么一定要有启动子 1 生物之间进行基因交流 只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达 2 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子 只将编码序列导入受体细胞无法转录 终止子的作用是什么 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断 能终止mRNA的转录 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将有目的基因的细胞筛选出来 标记基因有什么作用 1 原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 三 将目的基因导入受体细胞 2 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 1 农杆菌转化法 特点 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 原理 Ti质粒上的T DNA可以转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 转化过程 Ti质粒目的基因 构建 表达载体 植物细胞 植物细胞染色DNA 新性状 农杆菌 基因枪法又称微弹轰击法 是利用压缩气体产生的动力 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中 使目的基因与其整合并表达的方法 2 基因枪法 单子叶植物适用此方法 3 花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后 花粉管要穿过花柱直通胚囊 花粉管通道法就是在植物受粉后 花粉形成的花粉管还未愈合前 剪去柱头 然后 滴加DNA 含目的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 适用于被子植物 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄蕊 雌蕊 2 将目的基因导入动物细胞 程序 目的基因表达载体提纯取卵 受精卵 显微注射受精卵新性状动物 方法 显微注射法 微生物作受体细胞原因 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 过程 Ca2 处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 3 将目的基因导入微生物细胞 四 目的基因的检测与鉴定 分子水平检测 是否插入目的基因是否转录是否翻译个体生物学水平鉴定 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA 1 方法 DNA分子杂交 2 过程 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记 以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交 若显示出杂交带 表明染色体已插入染色体DNA中 一 检测 如果显示出杂交带 就表明待测样品含有目的基因或目