乙肝病毒基因检测和基因型ppt课件.ppt

乙肝检验新进展乙肝病毒基因检测和基因型 1 乙型肝炎全球分布 2 乙肝现状 乙肝病毒携带者占人口10 全世界共有3亿乙肝携带者 我国乙肝携带者总数高达1 3亿 10 转化为各种慢性肝病 包括有慢性肝炎 肝硬化和肝癌我国慢性肝病人数3000万 肝病死亡人数每年30万 3 国人感染HBV起始于幼龄期 幼龄感染成年感染 90 慢性化10 清除病毒急性肝炎 1 暴发肝炎 非活动性携带慢性肝炎 HBeAg HBeAg 40 肝硬化 95 清除病毒5 慢性感染 非活动性携带慢性肝炎 HBeAg HBeAg 15 20 肝硬化 4 HBV的感染过程 5 病毒性肝炎病毒性肝炎血清标志物包括 肝炎病毒本身组成该病毒的成分抗病毒抗体 血清标志物检测 6 乙型肝炎病毒标志物检测 乙型肝炎病毒 hepatitisBvirus HBV 为嗜肝DNA病毒 在电镜下可见大球形颗粒 小球形颗粒和管型颗粒 完整的HBV颗粒为大球形颗粒 又称Dane颗粒 直径42nm 分为包膜与核心两部分 包膜HBsAg 核心部分含有环状双股DNA DNA聚合酶 HBcAg和HBeAg等 是病毒复制的主体 7 8 乙肝病毒存在的三种形式 完整病毒颗粒 内含DNA 具有复制功能 空泡型病毒颗粒 无DNA 不具有复制功能 9 10 11 12 乙型肝炎病毒基因组结构示意图 13 乙肝抗原 1963年美国肿瘤研究所B S BIumberg在澳大利亚首先发现 称为 澳抗 又称肝炎相关抗原 乙肝病毒 1970年英国Dane在电镜下首先观察到乙肝病毒颗粒 是直径42nm的双层外壳的病毒颗粒 称为Dane氏颗粒 后来又有人发现26nm的核心颗粒 e抗原 1972年瑞典人Magnius发现与乙肝有关的第三种抗原 e抗原为一种可溶性抗原 在HBV核心的表层 14 HBV的复制过程 15 机体感染HBV后产生相应的免疫反应 形成多种不同的抗原抗体系统表面抗原抗体系统 HBsAg 抗HBs 核心抗原抗体系统 HBcAg 抗HBc e抗原抗体系统 HBeAg 抗HBe 16 临床意义 1 HBsAg 1 乙型肝炎具有传染性的标志之一 阳性常见于急性 慢性乙型肝炎 慢活肝 2 肝硬化 肝癌患者中有相当百分比的病人阳性 此现象说明肝硬化 肝癌患者有传染乙肝的危险 还说明了乙肝 肝硬化 肝癌发展演变的内在联系 乙肝是肝癌的病因之一 3 血液病患者 反复输血检出率高 17 18 4 无症状乙肝携带者 男性 女性 我国携带者约10 这种人虽然没有临床症状 体检肝功能正常或有轻微损害 有时ALT升高 血中抗 HBS 具有一定的传染性 不应作为供血者 可持续数周 数年这种人将来可能发生慢性活动性肝炎 迁延性肝炎 肝硬化和肝癌值得注意 19 抗 HBs 阳性表示 既往曾感染过HBV 现已恢复 接种乙肝疫苗后 被动性获得抗 HBs抗体 20 HBeAg HBeAg阳性表明 患有乙型肝炎 是病毒复制活跃 传染性强的指标 且HBeAg持续阳性的乙型肝炎 易转变为慢性肝炎 肝硬化 HBeAg HBsAg 的孕妇所生的新生儿 母婴垂直传播的机会很高 达90 值得重视 21 抗 HBe 意味着HBV部分被清除或抑制 复制减少 传染性降低 但慢性肝炎 肝硬化阳性率高e抗体和e抗原一般不同时存在 e抗原消失 e抗体产生 e抗体 说明患者曾出现过HBeAg但对e抗体 者不可视为HBV复制平息 22 抗 HBcIgM 是诊断急性乙型肝炎和判断病毒复制活跃的指标 并提示病人血液有强传染性 抗 HBcIgM阳性也可见于慢性活动性肝炎 抗 HBcIgG 高滴度表明机体正感染HBV 而低滴度抗 HBcIgG则是既往感染过HBV的指标 具有流行病学的意义 非保护性抗体 23 乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价 1 2 3 4 5 急性或慢性乙型肝炎 高传染性 急性 慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝 弱传染性 急性HBV感染康复期或有既往感染史 有免疫力 乙肝恢复期 弱传染性 急性HBV感染 窗口期 或既往曾感染过乙肝 接种HBV疫苗或HBV感染后康复 急性乙肝康复期 开始产生免疫力 无HBV感染 24 HBsAg抗 HBsHBeAg抗 HBe抗 HBc 25 乙型肝炎病毒前S1 PreS1 蛋白与抗 前S1抗体前S1蛋白是HBV外膜蛋白的成分 由108 110个氨基酸组成 通常连接在前S2蛋白的氨基末端 前S1蛋白第21 47位氨基酸为肝细胞膜的受体 HBV可通过这一受体粘附至肝细胞膜上 从而侵入肝细胞 前S1蛋白抗原性较强 可诱生机体产生抗 前S1抗体 临床意义 前S1蛋白阳性提示病毒复制活跃 具有较强的传染性 抗 前S1抗体是HBV的中和抗体 能阻止HBV入侵肝细胞 抗 前S1抗体较早出现提示预后良好 抗 前S1阳性 见于急性乙肝恢复早期 常表示HBV正在或已经被清除 是观察乙肝病情 了解预后及乙肝疫苗接种后是否有效的指标 26 前S1蛋白的存在导致免疫细胞的激活引发免疫损害 肝细胞坏死 转氨酶升高 黄疸出现 27 乙肝病毒前S1蛋白 前S1 28 HBVDNA 是HBV感染最直接 最灵敏和最特异的检测指标 且血清中HBVDNA的水平可作为治疗方案与疗效观察的指标 HBVDNA定量检测 29 循环数 扩增子数 靶序列拷贝数 122438416532664201 048 576301 073 741 824 10亿 目的基因扩增 30 PCR和PCR的定量问题 高浓度 高效率高浓度 低效率低浓度 高效率N 扩增分子的数量n 扩增循环数 对数期分析 N n 终点分析 31 LightCycler的定量概念 标准曲线 未知标本 CrossingPoint Cycles log copynumber n log F2 F1 n log F2 F1 Target 32 FQ PCR Taqman技术 荧光化学基础反应体系中 不仅有两条普通的引物 还有一条荧光标记探针 这条探针的5 端和3 端分别标记了荧光报告基团 R 和荧光淬灭基团 Q 当这条探针保持完整时 R基团的荧光信号被Q基团所淬灭 一旦探针被切断 淬灭作用消失 R基团的荧光信号就可以被测定 33 开始时 仪器并不能检测到荧光 阈值 因Taq聚合酶同时具有5 端外切酶的活性 在PCR反应的延伸阶段 Taq酶会把5 端的荧光分子切下 使其与3 端吸收或淬灭荧光的分子分开 仪器就会检测到荧光信号 每一个循环 随着PCR扩增产物的增加 荧光信号会增强 从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加 双标记探针 FQ PCR反应的实现 34 双标记探针 Taqmanprobes 35 36 1 HBVDNA检测结果与血清标志物的综合评价 与HBsAg检测结果的关系 一般来说HBsAg阳性 HBVDNA测定常常阳性 在实践中可能遇到的问题是HBsAg测定结果阴性 而HBVDNA测定阳性 其原因可能是因为 HBsAgELISA测定敏感性低 对极低浓度的HBsAg测不出 而PCR具极高的灵敏度 HBVDNA含量即使很低亦可检测出来 或在HBV感染早期 此时所有乙肝的免疫标志物尚未产生 37 与抗 HBs的关系 HBV感染恢复期 抗 HBs阳性 血清HBVDNA检测一般为阴性 但少部分亦可为阳性 特别是肝组织HBVDNA测定阳性率仍很高 说明HBV还没有从肝脏中完全清除掉 只有HBVDNA测定阴性才是病毒消除的明确指标 与HBeAg 抗 HBe和抗 HBc的关系 HBeAg阳性 HBVDNA检测几乎全为阳性 HBeAg阴性而抗 HBe和抗 HBc阳性者 仅表明病毒复制减弱 但并未完全消失 血清HBVDNA的阳性率仍可高达60 80 因此HBVDNA检测是评价HBV传染性的最可靠方法 38 2 抗病毒药物治疗乙肝的疗效评价使用定量PCR测定乙肝患者血中HBVDNA的含量在治疗前后的变化 可以判断相应药物的疗效 从而确定有效的治疗方案 3 筛查献血员 防止乙肝病毒输血后感染 39 HBV基因分型及其意义 杭州博赛基因诊断技术有限公司 40 HBV感染后常引起感染的慢性化 引起慢性肝炎 肝硬化 许多肝细胞癌患者也常常伴有HBV感染 不同的HBV亚型及亚型内特异部位的核苷酸位点的变异可能与感染的慢性化及感染后病情的转归有一定的关系 亚型突变与病变程度关系 41 乙型肝炎病毒 血清型 九个 基因型 A H型 乙肝的临床特征 HBV亚型的划分 42 血清型目前认为HBsAg含有5种不同的抗原表位 分别为a d y w r 其中 a 属于特异性抗原决定簇 d y及w r是2对亚决定簇 d与y w与r一般不同时出现 根据HBsAg的血清学分析 目前已知有9种亚型 主要的有adr adw ayw ayr等4种 各亚型的分布有明显的地区性 43 1排斥决定簇HBsAg主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d y 122 134aa指令d y决定簇 和w r 159 160aa指令w r决定簇 2四个主要亚型组成4个主要亚型 adw adr ayw和ayr 四个主要亚型 44 ayw 地中海沿岸 非洲 中近东 俄罗斯 印度 adr 分布于我国 朝鲜 日本 远东地区 adw 由东非 北欧 美洲 及澳洲等地 ayr 亚型极少见 流行病学意义 45 HBV基因分型 根据 全基因核苷酸序列异源性 或者 基因区核苷酸序列异源性 将不同病毒株分为不同的基因型 46 乙型肝炎病毒基因分型的方法 全基因序列比对分型法 限制性片段长度多态性分析法 RFLP HBV基因分型芯片 47 基因扫描图 48 限制性片段长度多态性分析法 RFLP 49 HBV的基因型和分布 根据 全基因核苷酸序列异源性 或者 基因区核苷酸序列异源性 将不同病毒株分为不同的基因型 迄今为止 可以分为 个基因型 即 和 型 50 HBV的异质性基因型 基因型 地理分布A北欧 西欧 美国 非洲B中国 印度尼西亚 越南C中国 越南 朝鲜 日本D地中海区 中东 印度E西非F美国 印地安拿人 波利尼西亚G欧洲 美国H尼加拉瓜 墨西哥 根据HBV全序列中核苷酸差异 8 ChuCJetal Hepatology2002 35 5 1274 51 17 2 81 4 53 32 12 2 84 7 0 20 40 60 80 100 中国 上海 台湾 日本 其他基因型 HBV基因型C HBV基因型B 亚洲部分地区的基因型分布 52 国内部分地区基因型分布 100 80 60 40 20 沈阳北京广州上海 53 HBV基因型的临床意义 近年来研究发现 HBV基因型具有如下意义与HBV标志物清除的关系与病毒致病性的关系与乙型肝炎的病程及转归的关系与药物敏感性的关系与HBV血清型比较 HBV基因型具有更加重要的意义 54 HBV基因型和HBeAg的清除的关系 临床资料显示 HBeAg的清除可能与 基因型有关 与 基因型相比 基因型有更高的HBeAg阳性率 分别为 与 基因型的自发性HBeAg清除要比 基因型 早 并且在HBeAg清除后 肝脏生化指标持续正常 55 50 5 55 24 0 10 20 30 40 50 60 18 30 31 60 年龄 岁 Frequency 基因型B 基因型C P 0 01 Kao Intervirology2003 46 400 407 不同HBV基因型患者中HBeAg阳性率比例与年龄的关系 56 HBV基因型与病毒复制及标志物表达的关系 Loggenomeequivalents ml ETSUROORITO etalHepatology2001 57 HBV病人肝硬化的累积可能性 JournalofMedicalVirology70 350 354 2003 58 HBV基因型和点突变 基础核心启动子区 BasicCorepromoter 双点突变 A1762T G1764A 常见的点突变 前核心启动子区G1896A导致提前出现终止密码子 HBeAg的消失 59 HBV基因型对点突变和alpha干扰素治疗的影响 ChunTaoWai etalHepatology2002 1425 1430 60 HBV基因型和HBsAg血清清除率 Hepatology 2004Jun 39 6 1694 701 61 HBV基因型与疾病类型的关系 日本学者Shiina分析了1744例HBsAg阳性者的基因型与肝功能异常的关系后发现 与B基因型相比 C基因型的肝功能异常更为常见 组织学炎症活动分数相关性的研究结果表明C型组织学病变更重 表明C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重 62 JournalofClinicalMicrobiology 2003 1277 1279 63 KAO等在进一步对67例无症状HBV携带 103例慢性肝炎 32例肝硬化 20例肝细胞癌患者进行基因分型研究中发现 各组均以B C型为主 C基因型所占比例按上述顺序逐渐增大 而B基因型的比例逐渐减小 与B基因型比较 C基因型在肝硬化患者中比例较高 而B基因型在50岁以下 特别是35岁以下的肝细胞癌患者比例较高 HBV基因型和肝细胞癌的关系 64 KaoJH JGastroenterolHepatol2002 17 643 650 不同基因型HBV患者中HCC发生率和年龄的关系 65 HBV基因型和HCC的存活时间 JournalofMedicalVirology65 257 265 2001 66 HBV基因型与抗病毒药物敏感性的关系 67 不同基因型HBV感染对干扰素治疗反应的差别 Kao对58例慢性乙型肝炎患者给予干扰素治疗48周 B基因型和C基因型的完全应答率 血清ALT恢复正常 HBeAg消失 HBVDNA转阴 分别为41 和15 说明干扰素对B基因型治疗效果较好 KaoJH etal JHepatol2000 33 998 1002 68 HBV基因型的临床意义 69 拉米呋定的疗效与HBV基因型的关系 KAO对31例HBeAg阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗 发现B基因型和C基因型患者的HBeAg HBeAb转换率分别为23 和11 B基因型优于C基因型 Intervirology2003 46 373 376 注 最近文献倾向于没有两者没有差异 70 型HBV感染者发生肝癌后 对栓塞治疗的反应优于基因 型 栓塞治疗后预后较好 而 基因型患者发生肝癌后 在栓塞治疗后仍继续发展 最终死于肝衰竭 HBV基因型和HCC栓塞治疗的关系 TsubotaA etal JMedVirol 2001 65 2 257 65 71 总结 特征基因型B型C型流行病学调查低高HBeAg阳性率低高HBeAg自然清除时间短长HBVDNA载量低高致病性轻重HCC发生率低 低年龄组高 高 高年龄组高 干扰素治疗完全应答率高低抗病毒治疗效果好差肝癌手术治疗预后好差癌栓栓塞治疗效果好差 72 乙型肝炎病毒B和C基因型荧光PCR检测 原理 采用Taqman荧光PCR技术 在一个PCR扩增系统中 加入两条基因型特异性荧光探针 一条探针检测HBVC基因型 FAM荧光素作为报告基团 另一条探针检测B基因型 VIC荧光素作为报告基团 监测荧光定量PCR仪上双通道实验数据 可以非常简便判断HBV基因型 73 TaqMan探针检测 5 3 5 5 3 5 R Q 5 3 5 5 3 5 TaqMan Probe R Q VIC标记 FAM标记 TaqMan Probe 74 乙型肝炎病毒基因分型与血清学分型的关系 乙肝病毒的同一血清型可分布在不同的基因型之中 尤其以adw血清型的核酸序列变异程度最大 如adw可分布在A B C三型之中 西藏的HBV基因型为C 并且至少存在两个亚型 占优势的是C D混合型 血清型为ayw 另一种为基因型C 血清型为adw 台湾大部分HBV血清型adw的基因型为B 所有血清型adr的基因型为C 生于大陆的患者感染血清型adr 基因型C的比例较高 75 特点 1 准确性好 与核酸序列测定分型比较 两者结果吻合率100 2 操作简单 耗时短 结果判断直观明确 试剂在荧光PCR检测仪上进行扩增和分型分析 根据双通道荧光增长曲线或Ct值即可直接判断HBV基因型 不需进行电泳 核酸纯化 紫外灯观测 测序反应等步骤 只需0 5 1 2小时即可完成PCR过程 有利于提高报告速度 3 有效防污染 PCR反应和分析在完全封闭的系统内进行 有效防范PCR产物污染 提高检测结果的可靠性 76 拉米呋定治疗后YMDD基因型变异 YIDD和YVDD 77 用拉米夫定治疗后 病毒的DNA聚合酶基因易发生突变 即P基因区的YMDD变异 YMDD变成YVDD或YIDD 拉米夫定失去了结合位点 因而产生耐药性 治疗一年时的基因突变率为12 16 治疗二年时的基因突变率为42 60 所以在临床上发现 发生病毒变异后 常表现为停药后反跳 因此 在治疗期间应进行YMDD变异的监测 以了解拉米夫定的耐药状况 78 拉米夫定治疗1年变异发生率 地域研究者发生率 亚洲Laietal16美国 欧洲Schiffetal27欧洲Heathcoteetal31美国Dienstagetal32欧洲Tassopoulosetal 27 包括纯变异型和混合变异型 HBeAg阴性 HBeAb阳性病人 包括推定的前 C区突变者 79 YMDD变异YMDD 酪氨酸 蛋氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 YVDD 酪氨酸 结氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 YIDD 酪氨酸 异亮氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 80 拉米夫定对野生型HBV的抑制 核苷类似物 拉米夫定 ss DNA 抑制 HBV聚合酶 野生型 高亲和力 M D Y D Y 酪氨酸M 蛋氨酸D 天门冬氨酸 81 拉米夫定和YMDD变异株HBV Y 酪氨酸V 缬氨酸D 天门冬氨酸I 异亮氨酸 在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株 Melegarietal Hepatology1998 Allenetal Hepatology1998 YMDD变异株 YVDDandYIDD 与核苷类似物的结合能力显著下降 Chayamaetal Hepatology1998 Backetal