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第四章人源性生物制品 1 2 第一节人源性生物制品的特点与种类1 1人源性生物制品的特点 1 效价高 疗效可靠2 安全性好 不易产生副反应3 稳定性好 便于保存和运输4 资源有限 研究意义重大 3 1 2人源性生物制品的种类 1 血液制品 血液制品是指由健康人的血浆或经特异免疫的人血浆 经分离 提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分 以及血液细胞有形成分 用于治疗和被动免疫预防 血液制品属于治疗用生物制品 4 血液制品 全血血液成分制品血浆蛋白制品 红细胞制剂白细胞制剂血小板制剂血浆制剂 白蛋白类制品免疫球蛋白类制品等 5 2 尿液制品人的尿液中含有许多重要的生理活性物质 目前产品有尿激酶 激肽释放酶 尿抑胃素 人尿胰蛋白酶抑制剂 人绒毛膜促性腺激素 HCG 等 6 3 胎盘制品人胎盘制品主要有人胎盘丙种球蛋白 人胎盘白蛋白 人胎盘RNA酶抑制剂等 7 4 人体液细胞中的活性物质人体液细胞包括红细胞 淋巴细胞 血小板 成纤维细胞等 这些细胞内的重要物质 也就是细胞因子具有重要的生理功能 8 1 3血液及其综合利用 1 血液的组成 A 无形成份 血浆50 60 红细胞白细胞血小板 40 50 B 有形成份 1 血液的成分 9 10 血液 血浆 血细胞血浆 血清 纤维蛋白原 凝血因子血细胞 白细胞 红细胞 血小板血液 流动在心脏和血管内的不透明红色液体 主要成分为血浆 血细胞血浆 血浆是血液的重要组成部分 呈淡黄色液体血清 血清 指血液凝固后 在血浆中除去 纤维蛋白 而得到的淡黄色透明液体 11 血浆蛋白的组成 12 2 血液的功能 A 输送氧气和二氧化碳 以进行肺与组织间的气体交换 B 维持渗透压 调节酸碱和电解质平衡 C 运输养份和代谢产物 传递维生素 激素和药物 E 防御和免疫 F 凝血和溶栓作用等 13 3 血容量 休克 渗透压 白蛋白 血容量指全身有效循环血量而言 有效循环血量是指单位时间内通过心血管系统进行循环的血量 而不包括贮存于肝 脾和淋巴血窦中或停滞于毛细血管中的血量 14 休克 在医学上是指由于多种原因引起的全身微循环障碍导致的临床综合征 微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环 是血液与组织细胞进行物质交换的场所 失血性休克 心原性休克 中毒性休克 过敏性休克 神经原性休克 15 渗透压 16 2 输血疗法的发展 输血发展史的里程碑1628Harvey血液循环1901Landsteiner血型1914Hustin抗凝剂1917Robertson 17 常用的抗凝剂ACDCPD 18 3 血液的综合利用 全血的缺点 大量输全血可使循环超负荷 B 全血输入越多 患者的代谢负担越重 C 全血容易产生同种免疫 不良反应多 D 全血内所含的成分不浓 不纯和不足一个治疗剂量 疗效差 E 全血是宝贵的社会资源 盲目输注全血是对血源的浪费 19 全血适应证 A 全血可用于急性大量血液丢失可能出现低血容量休克患者 B 存在持续活动性出血 估计失血量超过自身血容量30 的患者 我国临床输血技术规范规定 20 成分输血 把全血中的各种有效成分分离出来 分别制成高浓度的制品 然后根据不同患者的需要 输给相应制品 这是当前输血技术发展的总趋势 也是输血现代化的重要标志之一 21 成分输血的优点 A 制剂容量小 浓度和纯度高 治疗效果好 B 使用安全 不良反应少 C 减少输血传播疾病的发生 E 便于保存 使用方便 F 综合利用 节约血液资源 22 1 全血临床作用 缺点 输血反应 4 血液制品的种类 性质和用途 23 2 血液成分制品血液成分制品 bloodcomponents 专指用物理的或机械的方法分离出来的血液的一部分 如各种血细胞 血浆等 是从单个或血型相同的供者血液中采集的 24 红细胞制剂浓缩红细胞 将采集到多联袋内全血中的大部分血浆在全封闭的条件下分离出后剩余的部分所制成的血细胞成分血定义为浓缩红细胞 适应证 手术失血的输血 各种慢性贫血 CO中毒 高K 血症 肝 肾 心功能障碍者输血 小儿 老年人输血 25 添加液红细胞 这是一种从全血中尽量移除血浆后的高浓缩红细胞 红细胞压积可高达 由于原抗衡保存液被大部分移除 所含葡萄糖量很少 不能保存 加之红细胞很稠密 输往速度慢 放必须加入适量添加液才能克服这些缺点 添加液的配方有多种 都是特别设计的红细胞保存液 这是应用最多的一种红细胞成分 适应证与浓缩红细胞相同 但比浓缩红细胞好 其优点如下 血浆基本上被移除 显著减少了输血不良反应 红细胞被添加液稀释了 输往更流畅 一般用三联袋在密闭条件下制备 保存时间长 保存期因添加额不同而异 可长达 一 天 更充分地利用血浆 26 洗涤红细胞 全血经离心后在无菌条件下首先分出血浆并去除白细胞 向红细胞内加入无菌生理盐水混匀 再离心去除残余的白细胞 如此反复洗涤3次最终去除98 以上的血浆 90 以上的白细胞 血小板 同时也去除了保存过程中产生的钾 氨 乳酸等代谢产物 保留了70 以上红细胞 最后加入生理盐水悬浮即可 适应症1 输入全血或血浆后发生过敏反应 荨麻疹 血管神经性水肿 过敏性休克等 的患者 2 自身免疫性溶血性贫血患者和阵发性睡眠性血红蛋白尿需输血的患者 3 高钾血症及肝 肾功能障碍需要输血的患者 4 由于反复输血已产生白细胞或血小板抗体引起输血发热反应的患者 27 去白细胞红细胞 去白细胞红细胞是指通过白细胞滤器过滤或其他方法去除绝大部分白细胞 红细胞至少保留85 去白细胞红细胞适应证 由于反复输血或多次妊娠已产生白细胞或血小板抗体引起非溶血性发热输血反应的受血者 准备行造血T细胞或器官移植的受血者 预期需要长期反复输血的受血者 如再生障碍性贫血 白血病 重型地中海贫血等 可从第一次输血起就选用本制品 28 白细胞制剂生理功能 临床应用 缺点 TA GVHD 29 血小板制剂常规浓缩血小板 单采浓缩血小板 照射血小板生理功能 临床应用 缺点 人类白细胞抗原 humanleucocyteantigen HLA 30 血浆制剂 血液制品管理条例 原料血浆必须使用单采血浆机械采集 31 新鲜冷冻血浆 FFP 本品系经健康人 并用枸橼酸纳抗凝的单份全血中分出 于采血后6小时内在 18 或更低温度下冰冻制成 为淡黄色冰冻体普通冷冻血浆 frozenplasma FP 是全血在保存期内或过期5天以内经自然沉降或离心后分出的血浆 立即放入 30 C冰箱冰冻成块 即为普通冰冻血浆 冰冻状态一直持续到使用之前 有效期为5年 该制品内含有全部稳定的凝血因子 但缺乏不稳定的凝血因子V 和V 主要用于凝血因子V 和V以外的因子缺乏症病人的治疗 新鲜冰冻血浆保存期满1年 可改为普通冰冻血浆 新鲜液体血浆 freshliquidplasma FLP 保存期内的抗凝全血在低温下离心分离出的血浆 32 3 血浆蛋白制品血浆蛋白制品 plasmaproducts 是指从人血浆中分离制备的有明确临床疗效和应用意义的蛋白制品的总称 国际上将这部分制品称为血浆衍生物 plasmaderivatives 33 白蛋白类制品生理功能 A 维持血液渗透压 lg白蛋白声生的渗透压相当于20ml液体血浆或40ml全血 B 抗休克作用 能增加血液的有效循环量 对创伤 手术或烧伤所引起的休克有明显疗效 34 C 运输和解毒作用 白蛋白能结合阳离子 也能结合阴离子 故能输送性质不同的物质 如脂肪酸 激素 金属离子 酶和药物 并能结合有毒物质 运送至解毒器官 D 营养供给 组织蛋白和血浆蛋白可互相转化 白蛋白可作为机体内的氮源 为组织提供营养 35 免疫球蛋白类制品肌注免疫球蛋白制剂临床作用 缺点 制造方法 36 B 静脉注射免疫球蛋白制剂 IntravenousImmunoglobulin IVIG 临床应用 原发性和继发性免疫缺陷症特发性血小板减少性紫癜川崎病 37 C 特异性免疫球蛋白制剂 是用具有高效价的特异性抗体血浆为原料制备的免疫球蛋白制剂 与标准免疫球蛋白的制备工艺相同 只是采用的原料血浆不同 人乙型肝炎免疫球蛋白等 38 补体系统蛋白制品 补体系统是存在于血清和组织液中的一类不耐热的具有酶活性的一组蛋白质 补体并非单一分子 而是存在于血清 组织液和细胞膜表面的的一组不耐热的经活化后具有酶活性的蛋白质 包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白 故被称为补体系统 39 凝血系统蛋白制品我国现在能作的只有少数几种 凝血因子VIII凝血酶原复合物纤维蛋白原制剂等 40 5 血液制品的安全性 血浆相关病毒的概念 原料血浆筛查及检疫期管理 血液制品生产工艺去除病毒能力 血液制品病毒灭活 去除工艺 保证血液制品病毒安全性的其他措施 41 原料血浆的特殊性具有潜在的病毒风险 若获得起始原材料的过程和生产过程控制不严密 可能导致血源性传染病感染 甲型肝炎病毒 HAV 乙型肝炎病毒 HBV 丙型肝炎病毒 HCV 丁型肝炎病毒 HDV 艾滋病病毒 HIV 巨细胞病毒 CMV 人类细小病毒 HPV 朊病毒 CJDV 其他可通过血液传播的病毒 42 43 单采血浆站及单采血浆 血液制品是以人血浆为原料生产的 原料血浆来自单采血浆站采集的血浆 单采血浆站由血液制品生产企业设置和管理 应遵守 血液制品管理条例 单采血浆站基本标准 单采血浆站管理办法 和 单采血浆站质量管理规范 等法律法规的相关规定 44 血浆运输和贮存 血浆采集后 应在6小时内冻结 置 20 以下保存 保存期不超过3年 血浆用专用冷藏车在 15 以下运输 45 检验 用国家中检所检定合格的批批检试剂测定HBsAg HIV抗体 HCV抗体 ALT 梅毒 血浆蛋白 抗 HBs等其他抗体含量 46 原料血浆血清学的检测 HBsAg抗 HCV抗 HIVALT梅毒 47 原料血浆检疫期 2008年6月31日后建立原料血浆投料前的 检疫期 制度 血浆采集复检合格后放置90天等献浆员第二次献浆检测合格后投产 减少窗口期传染 若用NAT PCR检测 窗口期 可由90天缩短至60天 48 三种病毒的窗口期平均天数 ELISANATHCV8223HIV2211HBV5934 49 原料血浆采集管理流程 浆站 检测用试剂经国家批批检和入厂确认 采浆耗材经入厂检验合格 50 原料血浆管理 血液制品生产厂家 检测试剂SFDA放行检测试剂使用前蓉生确认 保留样品 51 血浆采集流程图 冷链运输 52 53 Cohn s低温乙醇血浆组分法 低温乙醇沉淀法生产工艺中可去除一定量的病毒 过滤法 包括用于IVIG的深层过滤 经确证能大量除去脂包膜和非包膜病毒 模型病毒为HBV HIV ParvovirusB19 HAV 工艺技术去病毒能力 54 白蛋白三步沉淀病毒Log减少数 工艺技术去病毒能力 55 IVIG三步沉淀病毒Log减少数 工艺技术去病毒能力 56 血液制品的病毒灭活 血液制品安全控制 原料血浆安全控制 不同层次的病原体检测方法 检疫期制度 排除潜在危险的血浆 病毒灭活 去除工艺及其效果验证 生产与质量管理 cGMP 质量标准与质量控制 57 病毒灭活方法 1 巴氏消毒法 巴氏消毒法 60 10h 即在60 0 5 连续加热10 11小时 白蛋白采用这个方法进行病毒灭活 通常是在除菌过滤 分装到最终容器以后进行加热处理 通常 为防止蛋白质变性 在除菌过滤前要加入低浓度的辛酸钠或辛酸钠与N 乙酰色氨酸作为保护剂 几十年的临床使用情况证明 采用低温乙醇法和巴氏灭活方法生产的白蛋白对肝炎病毒和HIV是安全的 58 2 干热法 80 72h 冻干品加热法蛋白质冻干除去水分以后可以耐受60 80 或更高温度 在80 以上加热可以产生令人满意的对HBV HCV HIV和HAV的病毒灭活效果 冻干品加热法一般多用于凝血因子类产品 由于冻干后病毒也更稳定 因此 必须进行在规定条件下的病毒灭活验证 冻干品加热法的病毒灭活效果受产品的水分残留量 组成成分如蛋白质 糖 盐和氨基酸的含量以及冰冻与冻干时间的影响 由于病毒灭活对水分残留量特别敏感 因此要根据验证结果设置允许的水分残留限度 并保持瓶间残留水分的差异处于限度内 59 3 S D法 S D法TNBP 0 3 Cholate 0 2 30 6h TNBP 0 3 Tween 80 1 24 6h TNBP 0 3 Triton 100 1 24 4 6h 有机溶剂与去污剂的混合物 S D 能够破坏包膜病毒的脂膜结构 导致受到破坏的病毒无法与感染细胞结合 但该方法不能灭活非脂包膜病毒 60 4 低pH法 pH 00 0 20 24 21天 低pH法在某些酸性条件下 脂包膜病毒可以被灭活 免疫球蛋白经低pH如pH4 处理 可以有效灭活几种脂包膜病毒 如在免疫球蛋白生产中 通常采用20 22 pH4 1培育21天 灭活条件如pH值 孵放时间和温度 胃酶含量 蛋白质浓度 溶质含量等因素 可能影响灭活效果 应确定这些参数允许变化的幅度 61 5 亚甲基蓝 法 MMB在白色荧光45000lux照射 小时 MB法已用于临床血浆的病毒灭活 62 6 荧光法 补骨脂S 59 150 M 结合UVA 3J cm2 63 7 纳米膜过滤法 使用20nm或50nm的膜过滤 8 射线法 64 病毒去除方法 沉淀层析 离子交换或亲和层析 纳米膜过滤 65 人体来源生物制品制备实例 Exampleofbio preparationapplicationtohuman 一 人血浆白蛋白制剂的制备 preparationofhumanbloodplasmaalbumin 1 结构和性质 structureandcharacter 人血是一种红色混浊的 具有一定腥味与粘滞性的液体 用适当的抗凝剂除去其中的有形成分 如红血球 而得到淡黄色 半透明的液体叫血浆 66 血浆中除含有大量的水分以外 还含有血浆蛋白等溶质 白蛋白 albumin 又称清蛋白 白蛋白是血浆蛋白中含量最高 3 8 4 8 分子量最小 分子数最多的一类蛋白质 白蛋白对治疗因失血 创伤 烧伤等引起的休克 脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高 防止低蛋白血症 肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效 67 白蛋白为单链分子 由584个氨基酸残基组成 N端为天门冬氨酸 C端为亮氨酸 分子量为6 6 104 在离子强度为0 15时 pI为4 7 易溶于水 在60 硫酸铵饱和度以上沉淀 对酸较稳定 受热变性 从人体中分离的白蛋白有两种 一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白 另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白 68 血 无抗凝剂 自然凝固 分离出血清 无纤维蛋白酶原 凝血因子等 69 2 工艺路线 图3 1 图3 1白蛋白生产工艺路线 利凡诺 NaHCO3 pH8 6 离心分离 络合物 蒸馏水 NaCl HCl 弱酸性 40 离心 离心液 浓缩 超滤 浓缩液 灭活病毒 65 1h 60 10h 热处理液 除菌 除菌过滤 白蛋白液 干燥 冷冻干燥 白蛋白 去杂蛋白 人血浆 70 血浆蛋白分离纯化的工业化生产技术 71 血浆蛋白分离纯化的工业化生产技术 72 血浆蛋白分离纯化的工业化生产技术 73 74 无菌灌装技术 75 巴氏病毒灭活和低pH孵放病毒灭活技术 76 77 二 尿激酶 urokinase 的制备 1 天然尿激酶是由两条肽链通过二硫键连接而成 是丝氨酸蛋白酶 丝氨酸 组氨酸是活性中心必需的氨基酸 该酶底物专一性很强 血纤维蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白质底物 作用于Arg Val键上 使纤溶酶原转为纤溶酶 2 尿激酶的pI为8 9 溶液状态不稳定 用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病 78 图3 2尿激酶生产工艺路线 79 4 工艺要点 收尿 男性尿 8h内处理 调尿液pH6 5以下 硅藻土吸附 加入1 的硅藻土 5 下搅拌吸附1h 洗脱 硅藻土吸附物用5 冷水洗涤后装柱 当洗脱液由清变浑时开始收集 除热原 色素 收集液用饱和NaH2PO4 调pH8 0 加NaCl调电导至22M 过DEAE SephadexA50层析柱 收集流出活性部分 80 CMC浓缩 流出液用1mol LHAc调至pH4 2 用蒸馏水调电导至16 17M 通过CM C层析柱 用10倍体积的pH4 2的HAC NaAc缓冲液洗涤柱床 洗后用0 1 氨水0 1mol LNaCl溶液洗脱尿激酶 收集活性组分 杂质被吸附 产品质量 无色澄清液或白色冻干粉末 酶活力 15000IU mg蛋白质 81 三 绒膜促性激素 HCG 的制备 1 HCG的性质 characterofHCG HCG是一种糖蛋白 由 两亚基组成 易溶于水 pI为3 2 3 3 HCG由胎盘滋养层合体细胞所分泌 妇女妊娠45 70天 尿中HCG含量可达30 000 50 000IU 24h 治疗女性不育症 神经性皮炎 男性性功能过低症和隐睾症 子宫出血和习惯性流产 82 图3 3HCG生产工艺路线 2 HCG生产工艺路线 83 3 工艺要点 吸附粗品 HCl调孕妇尿至pH4 5 加苯甲酸 乙醇饱和液 孕妇尿 苯甲酸乙醇饱和液 乙醇 1 0 075 5 搅拌1h静置2 3h 过滤 弃滤液 得吸附物 在搅拌下加入95 乙醇 至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生 静置过夜 离心 沉淀用95 乙醇和丙酮洗涤 干燥得粗制品 84 提取 加10倍量的4 1 15mol L pH4 8醋酸盐缓冲液 搅拌4h 离心 取上清液 沉淀再提取2h 合并两次提取液 弃去沉淀 离子交换层析 CM Sepharose柱用0 01mol L的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱 依次用pH4 8 0 01mol L的醋酸盐缓冲液和pH5 9 0 01mol L的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰 杂质 再用pH8 5 0 2mol L的醋酸盐缓冲液洗脱 得到的第3峰即为HCG 85 羟基磷灰石柱层析 柱用pH6 8 0 5mmol L磷酸盐缓冲液平衡 样品用pH6 8 0 5mmol L的磷酸盐缓冲液进行层析上柱 洗脱先用pH6 8 0 5mmol L再用pH6 81 0mmol L的磷酸盐缓冲液 得到I II活性峰 然后冷冻干燥 HCG纯品的比活性为10 000 12 000IU mg蛋白质 86 四 白细胞介素 2 IL 2 的制备 1 性质 由活化的淋巴细胞所产生的 糖蛋白有一个链内二硫桥 58位 105位 等电点为pH6 5 2 工艺路线 图3 4 诱生白细胞培养液 0 4mol LNaCl PBS pH6 5 UltrogelACA44柱 pH7 6 图3 4为IL 2生产工艺路线 87 3 工艺要点 诱生 刺激人外周血白细胞 37 培养 病毒灭活和固液分离 HCl调节pH再用NaOH调 除去变性杂蛋白 分级沉淀 加饱和硫酸铵溶液至0 35饱和度 4 静置24h 离心 收集沉淀 除盐 除沉淀溶于pH6 5 10mmol L的磷酸钠缓冲液 PBS 中 内含2 g 100mL 正丁醇