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温州市科技局计划项目可行性报告琥珀酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶激酶在鼻咽癌发生癌变过程中表达变化及临床意义一、 立项背景和意义鼻咽癌（ ，）为耳鼻喉科恶性肿瘤之首，占头颈部恶性肿瘤。在世界大多数地方是一种非常罕见的恶性肿瘤，具有显著的种族和地方分布的特点，好发于东南亚，比其他地区发病率高出大约倍。国内鼻咽癌分布有明显的地区性差异，以广东、广西为高发中心，向周围逐渐降低，其发病率高达万。鼻咽癌以男性居多，约为女性的倍，岁为高发年龄。是原发于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，其发病隐匿，其中以上的鼻咽癌为低分化鳞癌和未分化癌，高分化鳞癌较少见，发现时常已有颈部淋巴结和远处转移，大多数病人在确诊时已是第或第期。 鼻咽癌的发病因素是多方面的，多年来临床观察及实验研究表明，它与遗传因素、病毒、环境因素等紧密相关。由于病变位置隐蔽、发病症状无特异性，早期确诊率不高。目前鼻咽癌首选放射治疗，尽管癌细胞对放射治疗敏感，仍有较高的复发和(或)远处转移率，再放疗效果较差，特别是鼻咽癌的中晚期患者，年生存率不够理想，而且放疗常常引发各种并发症，例如咽鼓管功能障碍、涎腺损伤等。不少学者正在探索更有效的方法，如放射与化学药物联合治疗、放射与热疗联合应用和放射加中药治疗等。近些年来由于正电子发射断层显像()技术等在恶性肿瘤临床诊断上的成功应用，肿瘤细胞的糖代谢特异性重新引起人们的高度重视，探索通过靶向糖酵解代谢途径治疗恶性肿瘤的策略正备受关注，然而对恶性肿瘤的糖代谢过程中关键酶的选择是一个很关键的问题。 图鼻咽癌（电子鼻咽镜） ，奖获得者首次报道，肝癌细胞糖酵解活性较正常肝细胞明显增高，活跃的糖酵解代谢是恶性肿瘤细胞显著的生物化学特征，即使在有氧条件下，肿瘤细胞糖酵解仍明显增强，这一现象被称为效应。正常组织细胞在有氧条件下，糖酵解代谢受到抑制；只在缺氧时，其糖酵解代谢才代偿性增强。与线粒体有氧代谢相比，糖酵解代谢是个相对低效率的产能过程，一个分子葡萄糖通过有氧代谢途径净生成个分子，而一个分子葡萄糖经过糖酵解途径净生成个分子，因此线粒体氧化磷酸化轻度受抑，需要代谢明显增强的糖酵解才能补充足够能量，一些肿瘤细胞通过糖酵解合成的占总量的之多，而且糖酵解所致的酸性环境有利于肿瘤细胞生长。活跃的糖酵解代谢是肿瘤细胞恶性转化的生物能量学基础，改变了肿瘤细胞生物学特性，可导致肿瘤细胞对化疗或放疗等凋亡刺激产生耐受。首先，肿瘤细胞受内外因素影响，线粒体氧化磷酸化过程受到不同程度的抑制，糖酵解代谢可补充能量；其次，肿瘤细胞还可获取中间代谢产物，如脂肪酸、氨基酸等用于直接合成脂肪和蛋白质，以满足其活跃的合成代谢需求；再者，糖酵解产生大量乳酸，导致微环境酸化。早期酸化的微环境对肿瘤细胞生存有一定的不利影响，但肿瘤发生、发展是一个不断变异选择的过程。当耐酸的肿瘤细胞株优性选择形成，酸化的微环境则对肿瘤细胞有着保护作用，因为一些内源性免疫细胞、免疫分子以及外源性碱性抗癌药物在明显酸化的条件下均会失效，此外酸化的细胞外液对细胞基质有分解破坏作用，有利于肿瘤细胞的浸润与转移。目前技术正是利用肿瘤细胞摄入葡萄糖明显增多的特性来诊断肿瘤，而肿瘤细胞对葡萄糖摄入增加与糖酵解代谢活跃密切相关。现已有多种正电子核素显像剂，临床最常用的是利用氟标记的脱氧葡萄糖()，是葡萄糖的类似物，能被葡萄糖转运蛋白转运进入细胞，被催化为磷酸氟化葡萄糖，但磷酸氟化葡萄糖不能进入三羧酸循环参与分解代谢或被用于合成糖原，而是滞留于细胞内使沉积组织细胞显影。由于肿瘤细胞胞膜上葡萄糖转运蛋白数量增多和细胞内活性增加，其摄取并浓集能力明显增强，正是基于良、恶性病变之间的这种葡萄糖代谢水平差异，可被用于区别显示良、恶性病变。对肿瘤分期、分型，复发、转移的诊断，坏死与存活组织的鉴别，肿瘤生物特征的预测及治疗反应的监测作用等都得到了认可。随着临床诊断肿瘤的成功应用，极大地促进了人们对肿瘤细胞糖酵解特性的关注，然而利用肿瘤细胞糖酵解增高特性来治疗肿瘤的研究还处于探索阶段。随着肿瘤细胞糖酵解代谢增高机制、糖酵解酶亚型和功能的不断阐明，通过干预糖酵解途径来实现对恶性肿瘤靶向性治疗的策略正备受重视。 图 针向恶性肿瘤细胞糖酵解途径的作用靶点因此我们设想鼻咽癌细胞发生癌变时其细胞中线粒体呼吸受损，糖酵解代谢增强，本实验研究设计了利用半定量 和免疫组化方法分别检测 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织，一方面研究琥珀酸脱氢酶()、丙酮酸脱氢酶激酶（）在鼻咽癌癌组织、癌旁组织及正常组织不同组织中的表达变化；另一方面研究蛋白、 蛋白在鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同组织中的表达变化。如果实验如预期一样，我们得出结论 、基因表达水平与鼻咽癌发生、发展相关，三羧酸循环受抑制和糖酵解增强在鼻咽黏膜癌变过程中可能起到重要作用，针对鼻咽癌的糖代谢过程中关键酶，利用靶向糖酵解代谢途径治疗鼻咽癌提供了科学合理的依据。2、 国内外研究现状与发展趋势 、琥珀酸脱氢酶与恶性肿瘤关系 细胞有氧氧化分四个主要步骤：()糖酵解；()乙酰辅酶的形成；()三羧酸循环；()电子传递偶联氧化磷酸化。其中糖酵解在细胞质中进行，而乙酞辅酶的形成、三羧酸循环及电子传递偶联氧化磷酸化均在线粒体内进行。因此线粒体是细胞呼吸的重要部位。琥珀酸脱氢酶(，)位于线粒体内膜，三羧酸循环( ，)是线粒体呼吸链的组成部分。是氧化呼吸链中最小的复合物，由核基因编码，含有辅基、个铁硫中心和个细胞色素，由个亚基构成: (，黄素蛋白)、(，铁硫蛋白)、与。其中与是催化亚基，构成水溶性的具有催化活性的异二聚体，由两个跨膜蛋白、亚基位于线粒体内膜。作为参与三羧酸循环的一个重要的催化酶，催化琥珀酸转变成延胡索酸，是反映线粒体功能的标志酶之一，其活性可作为评价三羧酸循环运行程度的指标；同时是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，因此的改变必然会影响细胞有氧呼吸过程。是的催化亚基，其表达缺失可导致活性的丧失，从而引起线粒体三羧酸循环功能障碍。三羧酸循环是线粒体细胞氧化的重要步骤，细胞能量供应主要来自糖酵解和线粒体有氧氧化，因此，表达缺失可引起肿瘤细胞能量代谢紊乱。近年来，能量代谢紊乱在肿瘤发生与演变过程中的作用及机制逐渐受到重视，通过干预能量代谢方式抑制肿瘤生长已经成为肿瘤研究与治疗的一个新的思路。我们分析，表达下调或缺失导致活性降低，造成线粒体三羧酸循环的功能障碍，导致恶性肿瘤能量代谢紊乱。一方面，功能丧失可以导致的活化，而的活化可以促进糖酵解基因如葡萄糖转运蛋白、乳酸脱氢酶等的表达，以促进糖酵解。另一方面，是的催化亚基，表达缺失可以导致活性的丧失，从而引起线粒体三羧酸循环障碍，最终导致线粒体有氧代谢降低、糖酵解增强，促进肿瘤的生长与侵袭转移。因此表达降低引起活性下降可能是恶性肿瘤能量代谢紊乱的机制之一。目前研究认为基因突变导致活性丧失，从而抑制了的降解，活化的激活了下游一系列靶基因而介导了肿瘤的发生、发展。同时发现在基因缺陷的肿瘤细胞或组织中的表达明显增高。近年研究发现和突变的肿瘤有明显的差别：基因突变大多数与头颈部副神经节瘤有关，而突变在肾上腺和肾上腺外嗜铬细胞瘤以及非副神经节瘤肿瘤中发生率更高，突变也与恶性嗜铬细胞瘤、部分肾细胞癌等恶性以及转移性肿瘤发病相关。的亚基突变导致酶活性降低，造成三羧酸循环功能紊乱，触发糖酵解增强成为产生的主要来源。同时由于的失活，其催化底物琥拍酸在线粒体基质中积聚，并渗漏到胞浆中，进而抑制了脯氨酞轻化酶(，)，的抑制导致了肿瘤细胞对某些凋亡信号产生抵抗和或激活缺氧诱导因子( ，)，从而促进了肿瘤生成与发展 。、丙酮酸脱氢酶激酶（）表达与鼻咽癌关系 丙酮酸脱氢酶()是调节细胞糖酵解的关键酶之一，丙酮酸脱氢酶激酶( ，)是细胞糖酵解关键限速酶丙酮酸脱氢酶()的调节酶，有种同工酶：、以及。有三个特异调节位点，其中种同工酶均能磷酸化位点和，而位点只能被磷酸化。所以能多点磷酸化三个位点，并与的长期抑制有关，的激活使被抑制，从而限制了丙酮酸流入线粒体进行氧化磷酸化，而在胞浆进行糖酵解。此外，促进肿瘤细胞发生糖酵解，因此它对肿瘤细胞凋亡的拮抗也有很大的影响。既往研究发现在非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部癌、肾癌细胞中表达增高。但是否能作为治疗鼻咽癌的有效治疗靶点还需进一步明确。线粒体功能的维持在细胞生长、增殖、凋亡中有着十分重要的作用，细胞生长增殖离不开线粒体是因为即使在肿瘤细胞倾向于糖酵解获取能量时仍有的能量是通过线粒体获得的。而凋亡也是依赖于线粒体能量的产生。在线粒体里有很多促进凋亡的分子，如细胞色素和凋亡诱导因子，在线粒体膜电位正常时它们存在于线粒体内，而当呼吸链中的电子链产生电子(，)时，线粒体膜电位才能降低，它们就流入到胞浆内，诱导细胞发生凋亡。有研究表明，抑制了三羧酸循环的进行，从而导致了线粒体功能失常。因此，抑制是否通过对线粒体功能的改变而影响结鼻咽癌细胞增殖和化疗敏感性也是本研究的关注点之一。研究发现的表达可被缺氧诱导因子调控，可能与肿瘤缺氧的环境有关。除了具有糖代谢酶的催化活性，对细胞凋亡拮抗还有一定的影响，线粒体功能的调节在细胞的生长、增殖、凋亡等过程中发挥重要的功能。它具有能够调节，催化丙酮酸脱羧氧化的活性，并进一步将糖酵解与三羧酸循环以及的生成联系在一起。许多研究证明在多数恶性肿瘤组织中都有表达，并且与肿瘤恶性程度关系密切。预示着和可能成为判断结鼻咽癌恶性程度的重要指标。这也与文献报道在头颈部鳞癌中受调控的研究结果一致，故有可能成为鼻咽癌研究和治疗的一个新靶点。具有促进能量合成和拮抗细胞凋亡的双重功能，线粒体功能的维持在细胞生长、增殖、凋亡中有着十分重要的作用，细胞生长增殖离不开线粒体是因为即使在肿瘤细胞倾向于糖酵解获取能量时仍有的能量是通过线粒体获得的。而凋亡也是依赖于线粒体能量的产生。在线粒体里有很多促进凋亡的分子，如细胞色素和凋亡诱导因子，在线粒体膜电位正常时它们存在于线粒体内，而当呼吸链中的电子链产生电子(，)时，线粒体膜电位才能降低，它们就流入到胞浆内，诱导细胞发生凋亡。同时，线粒体也能影响跟增殖和凋亡有关的下游机制，如对胞内钙离子浓度的调节。胞内钙离子浓度也是维持细胞生理稳定的重要指标之一，它的增高会引起细胞的增生和很多转录因子的激活。有研究表明，抑制了三羧酸循环的进行，扰乱了正常的线粒体工作程序，从而导致了线粒体功能失常。因此，抑制是否是通过对线粒体功能的改变而影响结鼻咽癌细胞增殖和化疗敏感性也是本研究的关注点之一。 从临床的观点来看，鼻咽癌的综合治疗主要包括放疗、化疗和手术，但肿瘤的本质是细胞在基因水平上失去对其生长增殖的正常调控。因此基因治疗与放疗等传统手段相结合可能取得比单一治疗方法更好的效果。针对鼻咽癌的糖代谢过程中关键酶，抑制肿瘤增殖，促进凋亡，进一步提高肿瘤细胞对放、化疗等敏感性，对鼻咽癌患者采用联合疗法即放、化疗联合靶基因治疗，可能会有意想不到的疗效。参考文献黄选兆，汪吉宝，孔伟佳等。实用耳鼻咽喉头颈外科学，第二版，北京，人民卫生出版社，。 (). (). , (). . (). (). . (). (). .() (): . ():. . (). (). (). . (). (). (). (). (). (). . (). ()：菅记涌，张勇，朱大海。丙酮酸脱氢酶激酶的研究进展。基础医学与临床，()。 . . . . (). . . . () . . ， ， ， . (). () ().3、 项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点。（1） 研究开发内容 用半定量 和免疫组化方法分别检测 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中、 和蛋白的表达水平变化及其生物学意义。、利用半定量 法检测 、在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中表达水平变化。、利用免疫组化法检测、蛋白在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中的表达水平变化。（二）技术关键、活检患者癌组织、癌旁组织以及正常鼻咽癌组织，每位鼻咽癌有完整的临床资料、病理分级，病人术前均未行化疗、放疗。、利用半定量 法检测 、在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中和的表达水平变化。、利用免疫组化法检测蛋白 、蛋白在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中的表达水平变化。（三）科研创新 、基因表达水平与鼻咽癌发生、发展相关，三羧酸循环受抑制和糖酵解增强在鼻咽黏膜癌变过程中可能起到重要作用。针对鼻咽癌的糖代谢过程中关键酶，利用靶向糖酵解代谢途径治疗鼻咽癌提供了科学合理的依据。() 、和蛋白表达水平与鼻咽癌发生、发展相关，三羧酸循环受抑制和糖酵解增强在鼻咽黏膜癌变过程中可能起到重要作用。()鼻咽癌组织、癌旁组织中 和蛋白表达显著低于正常组织；鼻咽癌组织、癌旁组织中和蛋白表达显著高于正常组织。()、作为靶基因为鼻咽癌的糖代谢靶向治疗提供科学依据。四、项目预期目标、实验预期在鼻咽癌组织、癌旁组织中表达显著低于正常组织（ ）；、实验预期鼻咽癌组织、癌旁组织中蛋白表达显著高于正常组织（ ）。、预期等级相关分析结果显示、基因表达水平与组织的病理学分级呈显著负相关（ ）。、本研究成果将在国内外期刊发表篇，并通过国内学术交流、继续教育等形式进一步推广应用。应用前景目前，鼻咽癌的糖代谢靶向治疗成为恶性肿瘤治疗的主要研究方向。检测、和蛋白在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中的表达水平变化，这样可以在分子水平抑制肿瘤细胞的生长，进而达到综合治疗目的。五、项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解（一）实施方案、活检每位鼻咽癌患者癌组织、癌旁组织以及正常鼻咽癌组织。、检测 、在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中和的表达。、检测蛋白 、蛋白在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中和的表达水平变化。、分析和的表达水平变化两者相关性。、实验结果分析：使用统计软件如，对实验数据进行统计、分析。（二）技术路线 病例标本产物琼脂糖凝胶电泳 软件分析扩增片段 提取组织总 病例标本逆转录成测定纯度及浓度 石蜡切片 免疫组化法（三）组织方式 项目负责人实验组 实验组 数据分析 其中项目负责人负责本项目的管理和协调；实验组、负责试剂等采购和本项目的实验室操作；数据分析组负责对结果检测和数据进行分析。（四）课题分解、活检每位鼻咽癌患者癌组织、癌旁组织以及正常鼻咽癌组织，由实验组负责。、检测 、在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中和的表达，由实验组负责。、检测蛋白 、蛋白在 例鼻咽癌组织、癌旁组织及正常组织不同病理阶段组织中和的表达水平变化，由实验组负责。、实验数据分析 实验结果使用统计软件如，对实验数据进行统计、分析，由实验数据分析组负责。六、计划进度安排年月年月（第一阶段）准确活检每位鼻咽癌患者癌组织、癌旁组织以及正常鼻咽癌组织。年月年月（第二阶段）检测、 和蛋白的表达水平变化在 例鼻咽