生物技术在大豆育种中的应用进展.doc

生物技术在大豆育种中的应用进展摘要：随着科学技术的发展，作物的育种方法也日新月异。大豆是世界上食用油和食用蛋白的重要原料，目前已成为一种世界性的主要农产品，实现大豆的高产，就必须应用新的先进的育种方法。目前主要的方法有RF LP，随机引物扩增多态性标记(RAPD)，扩增片段长度多态性(AF LP)，微卫星标记(SSR)，简单重复序列间扩增( ISSR)，单核苷酸多态性(SNP)。这些标记技术已经在大豆育种遗传连锁图的构建，基因定位中取得一系列研究进展。相信分子标记技术在大豆育种中的应用会越来越广泛。关键词：大豆育种；分子标记；应用大豆是世界上食用油和食用蛋白的重要原料，国际大豆贸易非常活跃 。大豆起源于我国 有 5000多年的种植历史 后来大豆的栽培技术由中国传到日本，并经欧美等地传向世界，目前已成为一种世界性的主要农产品1。 世界大豆生产集中在美国，巴西，阿根廷，中国和印度。2005年我国大豆单产114 千克/亩，世界平均153千克/亩。我国大豆消费量不断提高，每年约为4300万吨左右， 而国产大豆仅为 1500-1700万吨 。2007年国产大豆1440万吨 ，进口大豆3182 万吨，2008 年国产大豆 1500万吨，进口大豆 3700万吨，2009年国产大豆1450 万吨，进口大豆4248万吨2。所以在今后相当长的时间内，提高单产依然是我国大豆育种的主要目标，在此基础上兼顾高蛋白或高油 。品种在大豆增产中的作用已不容置疑， 品种在大豆生产中的贡献率达30% 以上。 选育优质，抗病，高产的大豆品种是大豆科技和生产发展中的主旋律，受到世界各国的普遍重视。因此，在品种选育上要有新的突破就是要选育产量上有重大突破的超级品种，这是十一五国家已确定的育种目标。实现这个目标必须提高育种技术水平，拓宽遗传基础，采用生物技术与常规技术相结合的新方法进行高效育种。为此要特别在以下方面取得突破：一是在超高产类型上取得突破，抓住抗倒，簇荚，抗病，耐密植，高光效的性状， 构建理想株型实现产量的突破；二是在资源上取得突破，广泛引入国外优异资源，采用常规鉴定技术和生物技术挖掘资源的遗传潜力，为育种提供优秀的亲本和优良基因 。三是在育种手段上取得突破，采用分子生物学的手段，应用生物技术与常规育种相结合的方法， 运用仪器的分析，试验场条件的培育选择，构建和识别优异的变异个体，变传统育种为现代育种在大豆品种的培育上迈上新台阶3。1. 分子标记简介分子标记始于20世纪80年代，它是DNA水平遗传多样性的直接反映。DNA分子标记技术具独特的优点:遗传多态性高;有些分子有共显性遗传(即利用分子标记中可鉴别二倍中杂合体杂合基因型和纯合基因型)，信息完整;基因组中大量存在且分布均匀;表现为中性无基因多效性)，不影响目标性状的表达;定性和重现性好，信息量大，分析效率高;检手段简单快捷，实验程序易于实现自动化;开成本和使用成本低等。2003年，我国分子标记育种研究与应用已逐渐居于世界前沿水平。开发出487个EsT一SSR标记及其应用软件，分子标记辅助育种中所用的标记已开始实现从主要由国外引进到国外实用我国的分子标记的转变，在小麦、大豆、水稻等作物遗传图谱的构建上也取得了重要进展4。200一2003通过品种审定的高产、优质、抗病虫、抗逆新品种有51个，还有94个新品系进人区试阶段。分子标记育种是在水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、油等农作物上，通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择，在早代就能够对目标基因的转移进行准确、稳定的选择，且能克服隐性基因再度利用时识别困难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质高产的品种。我国农作物分子标记育种研究始于20世纪90年代初，在过去几年时间里，取得了重要进展。我国无论从新基因的发掘、新型分子标记开发重要目标紧密连锁的分子标记的筛选鉴定、利用分子标记辅助选择转育、追踪、聚合优异目标基因以通过回交、聚合杂交选育高产、优质、抗病虫、抗逆品种等方面，均取得了非常显著的成果。在国内学术刊物上共发表文章254篇，其中SCI收录文41篇5，在分子标记及辅助育种领域的许多研究果都已申请了中国国家发明专利。目前，新申请国家发明专利达41项，获得国家发明专利11项，我国利用分子标记技术培育新品种提供了保障。2.分子标记的主要方法2.1RF LP( restriction fragment length polymorphism) 是由Bostein (1980)首先提出 ,并在 80 年代初发展起来的第一代分子标记技术。它是指 DNA 经限制性内切酶消化后 ,通过与探针进行杂交而检测到的 DNA片段长度多态性。这种多态性与限制性内切酶在DNA上识别切点的分布有关。RF LP反映了DNA水平上的变异 ,任何DNA序列的改变如插入、 重排、缺失等都会改变原有酶切位点所在位置 ,从而使两酶切点间的 DNA 片段长度发生变化 ,这种变化经酶切 ,杂交及放射自显影就会使 RF LP 带的特征有所改变 ,由此即可对生物的变异进行分析。RF LP标记的优点是:无表型效应 ,其检测不受环境条件和生物的发育阶段影响，共显性 ,可以区别纯合基因型和杂合基因型;可利用的探针多 ,可以检测到多个遗传位点。缺点是:对DNA质量要求高 ,需要量大 ,操作复杂 ,通常要接触放射性。该技术常用于遗传图谱的构建以及对一些农艺上较为重要性状基因的定位 6。 2. 2 随机引物扩增多态性标记(RAPD)RAPD( random amplified polymorphism DNA)标记是1990年由Will Jan和Welsh同时提出的 ,该标记是以一系列随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物 ,对所研究的基因组 DNA 进行 PCR 扩增 ,当某一引物同模板DNA有互补的结合位点时 ,这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合 PCR扩增条件 ,即引物在模板的两条链上有互补位置 ,且引物的两端相距在一定长度范围内(2004 000bp) ,就可以扩增出 PCR片段。如果基因组 DNA 在这些区域发生变异就会使引物 模板 DNA 的结合位点发生变化 ,从而导致 PCR扩增片段的有无及片段大小发生改变 ,通过 PCR 扩增产物的检测 ,即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。RAPD技术的优点在于它操作简便、快速、只需要少量的DNA、对DNA制备的质量要求不高、无需同位素或非同位素标记且一套引物可用于不同生物的基因组分析,所以RAPD标记在生物学的许多领域都得到了广泛应用,如遗传图谱构建、 基因定位和克隆、外源导人基因的跟踪、物种亲缘关系和进化关系研究、品种鉴定等。但 RAPD技术也有不足之处 ,其缺点是绝大部分 RAPD是显型标记,不能区分基因型是纯合或是杂合的,每个标记提供的信息量少,并且重复性差7。2. 3 扩增片段长度多态性(AF LP)AFLP ( amplified fragment length polymorphism) 技术由 Zabeau 等 1992 年创立 ,是在 RF LP 与 RAPD 两种指纹技术基础上建立和发展起来的,AF LP的基本原理是通过 PCR选择性地扩增整个基因组 DNA 的内切酶片段 ,在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上电泳产生一组特异的 DNA 限制性片段的指纹图。AF LP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD与 RF LP优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。该技术在高密度遗传图谱的构建基因定位、遗传多样性检测、分子标记辅助育种、系统分类等研究领域得到了广泛的应用。但有研究认为,AF LP对基因组纯度和反应条件要求较高 ,另外用于遗传作图时,少数的标记与图谱紧密度有出入并且需要用同位素来检测,相对比较费时耗财8。2.4 微卫星标记(SSR)SSR(simple sequence repeats)标记是由16个核苷酸为单位串联重复达几十个甚至上百个的核苷酸序列。SSR 序列两侧顺序常较保守,在同种而不同遗传型间多相同,呈孟德尔式遗传,共显性,对个体鉴定具特殊意义;SSR在品种间具广泛变异位点,多态性非常丰富 ,可以区分纯合基因型和杂合基因型;同时 SSR技术稳定性好,重复性高 ,检测技术简便快捷,实验成本低;对DNA数量及纯度要求不高,仅需微量组织,即使部分DNA降解,仍能有效使用;引物序列公开发表,易在各实验室中广为传播使用。根据 SSR座位两侧相对保守的单拷贝序列设计引物,进行 PCR 扩增,经电泳、显色后,比较谱带的相对迁移距离,便能测出不同个体在某个 SSR 座位上的多态性,在此基础上进行相应的分析。基于以上特点,SSR 标记在大豆基因及 QT L 分析,辅助育种,资源保护与利用,品种系谱分析等领域都具有广泛的应用。SSR分析的缺点是必须针对每个染色体座位的 SSR,测定并找到其两端的单拷贝序列设计引物9。2. 5 简单重复序列间扩增( ISSR)ISSR(inter - simple sequence repeats)是Zietkiewicz于1994年提出的一种新的分子标记技术。它的生物学基础是真核生物基因组中广泛存在着 14 个碱基组成的简单重复序列(SSR) ,并利用加锚微卫星寡核苷酸做引物在 SSR 5端或 3端加上 24 个随机选择的核苷酸 ,这可引起特定位点退火。从而保证了引物与基因组 DNA 中SSR 的 5或 3末端结合,导致位于反向排列,间隔不太大的重复序列间的保守 DNA 序列的 PCR 扩增。SSR 在真核生物中的分布是非常普通的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的 ISSR - PCR 可以检测基因组许多位点的差异。与 SSR - PCR 相比,用于ISSR - PCR 的引物不需要预先的DNA测序,也正因如此,有些 IS2SR引物可能在特定基因DNA 中没有配对区域而无扩增产物,通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,且具有很好的稳定性和多态性。目前 ISSR 技术已广泛用于植物品种鉴定、 遗传作图、 基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中10。2. 6 单核苷酸多态性(SNP)SNP( single nucleotide polymorphism)是指发生在DNA上某个特定位置上的单个碱基变异 ,这种变异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核苷酸的替换,而且经常发生在嘌呤碱基(A 与 G)和嘧啶碱基(C与 T)之间。SNP 在生物基因组中广泛分布,发生在编码区位置的 SNP 称为 cSNP (coding re2gions SNP) ,此外在基因的 5、3 端非编码区,以及内含子上都有发生。SNP与第 1 代的 RF LP 及第2 代的SSR标记的不同有两个方面:其一,SNP 不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;其二,SNP标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的 DNA 芯片技术。SNP在植物基因组中广泛存在,具备多态信息量大、易于检测和统计分析等优点,在一定程度上弥补了以前各种DNA分子标记方法的不足,成为继 RF LP 和微卫星多态性之后的第三代遗传标记方法。目前 SNP技术作物基因作图及其整合、 分子标记辅助育种和功能基因组学等领域展示了广泛的应用价值11。3.分子标记在大豆育种上的应用3.1遗传连锁图的构建遗传图谱是数量性状基因定位(QT L) 、基因图位克隆、比基因组学研究以及分子标记辅助育种等的基础。我国大豆遗传图谱研究工作始1997 年,张德水等（1997)应用长农4号 新民6号,以RF LP标记为主进行连锁群分析12,构建了2 0个连锁群,共分布有71个标记13,其中,RF LP标记 63 个、RAPD 标记 8 个,标记间的平均距离 20.4M,覆盖长度1446.8 cM,是我国构建的首张大豆分子连锁图谱14。截至2005年,共利用长农4 号新民6 号、 科丰1 号 南农113822、 晋豆 23 灰布支黑豆、科新 3 号 中黄 20、D2 BX10、美国大豆Charleton 东农59等6个不同群体构建了10张遗传图谱。巩鹏涛(2006)对宛煜嵩等利用重组自交系群体Jin f 构建的含有227个SSR标记的图谱的基础上进行整合。整合后的大豆分子遗传图包含315 个 SSR标记和40个AF LP标记,总图距为1 951.7 cM,相邻标记间的平均图距为5.48 cM 15。朱晓丽(2006)和宋显军(2007)也分别利用绥农14 绥农20和沈农6号 OhioFG 1群体,构建了包括120个SSR标记,27个连锁群和170 个SSR标记,27个连锁群的大豆遗传图谱16。3.2 基因定位3.2.1 质量性状基因定位 质量性状的基因定位相对简单它可在已知目标基因位于某一染色体或连锁群上的前提下选择该连锁群上不同位置的标记与目标基因进行连锁分析郭蓓等(2000)采用BSA法筛选出大豆耐盐和盐敏感基因座位有关的RAPD标记17。王永军等(2004)对大豆5个花叶病毒株系进行了抗性基因定位18。王惠等(2007)筛选出与大豆胞囊线虫抗性基因相关的1个SSR标记 Satt18719。大豆质量性状基因定位方面还有很多成功的例子。3. 2.2 数量性状 QT L 定位自 K eim等(1990)发表第一篇大豆QT L 定位文章以来20,随后许多学者利用已构建的大豆遗传图谱对大豆重要农艺性状进行了QT L 定位分析。到目前为止,已有1174个大豆QTL 定位结果储存于大豆数据库网站 Soybase (www. 129. 186.26.94)。定位所用标记以SSR、RF LP居多。吕祝章(2006)对蛋白质含量、脂肪含量、产量、百粒重、生育期5个数量性状进行QT L 定位和遗传效应分析,共检测到16个QTL 位点,遗传贡献率在7.4 %33.7 % 21。陈庆山(2007)获得了大豆 12 个重要农艺性状的 68个主效QT Ls 22。在对产量性状QT L 研究中,Mian等(1996)在2个不同的大豆群体中分别检测到7 个和9 个影响粒重的QT L ,这些QT L 在不同的年份和环境下表现高度一致23。Chung等(2003)报道了2个和大豆产量、 油分以及蛋白质紧密连锁的SSR标记(Satt496和Satt239) 24。Seb olt 等(2000)利用野生大豆群体,分别定位了位于I连锁群位点Satt127和A144-1附近的可解释表型变异65 %的2 个蛋白主效QT L 以及2 个遗传贡献率为39 %、 15 %的脂肪QT L 25。吴晓雷(2001)发现了位于B1连锁群上的 Satt197 和蛋白质含量有关。王晓丹(2005)鉴定出了2 个与蛋白质含量QT Ls密切相关的 SSR标记Satt202和Satt551 ,并鉴定出2个与油分含量QT L 紧密连锁的标记Satt345和Satt472 26。高文瑞等(2007)研究了大豆籽粒大小的遗传及 SSR 标记分析,得出了 6 个 SSR 标记在J280082 海系13和巴马九月黄 海系13这2个群体中都表现出与籽粒大小相关,其中satt302和satt070在2个群体中对籽粒大小性状变异的解释率都较高( 8 %)。Panthee 等(2007)定位了 1 个与产量性状 QTL 密切相关的SSR 标记Satt076 ,2个和倒伏性相关的 SSR标记 Satt225和 Satt593 ,4个和成熟期QTL 紧密相关的SSR标记 Satt263、 Satt292、Satt293、Satt59127。4.分子标记育种的研究展望分子标记辅助育种是以基因的研究和利用为核心。分子育种的发展离不开常规育种，而且在今后相当长的一段时间内，常规育种方法在作物品种选育中将起重要的主导作用。然而，以抗除草剂转基因品种为代表的作物分子育种在全球的发展事例证明，作物分子育种正在并将在作物育种中发挥越来越大的作用。在大豆育种日新月异的今天, 生物技术对大豆品质改良,抗性提高等方面起着举足轻重的作用。我们有理由相信, 未来几年,我国农业必将以生物技术为龙头迈向更高的台阶。参考文献1陈应志.大豆品种管理与推广技术指南M.北京：北京农业科学技术出版社，20072季志强.我国大豆产业现状及承德农科所在野生大豆利用方面取得的进展J.中国种业 2009 增刊 21-223季志强 ，盖颜欣 ，王 奇等. 国内外大豆生产概况及大豆育种的发展方向J.农业科技通讯，2010，74周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用M.北京:化学工业出版社，2005.5张志是，付秀芹，孙继英，等.生物技术通讯，2008，19(2):303-3056陈绍江.大豆分子标记研究进展J .大豆科学 ,1995 ,14(4) :334 - 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