积雪草中皂苷的提取方法.doc

北京化工大学北方学院毕业设计（论文）文献综述北京化工大学北方学院NORTH COLLEGE OF BEIJING UNIVERSITY OF CHEMICAL TECHNOLOGY（2013）届本科生天然产物有效成分提取大作业题目： 积雪草中皂苷的理化性质及提取分离方法 学院： 理工院 专业： 化学工程与工艺 学号： 090101117 姓名： 崇阳 指导教师： 刘雪凌 教研室主任（负责人）： 刘军凯 2012年06月18日积雪草中皂苷的理化性质及提取分离方法积雪草苷和羟基积雪草苷的性质和一般分离方法崇阳化学工程与工艺专业 化工0905班 学号090101117指导老师：刘雪凌老师摘 要目的是了解积雪草的主要有效成分的性质，药理作用和提取分离方法。皂苷（saponins）又称皂素，是由皂苷元和糖、糖醛酸或无机酸形成的一类复杂的苷类化合物，其水溶液在振荡时能产生大量持久的蜂窝状泡沫，与肥皂相似。大量研究文献表明，积雪草苷和羟基积雪草苷等三萜皂苷类成分为积雪草中的主要活性成分1。目前，积雪草苷常用的提取方法有：水煎煮、高浓度乙醇提取、乙醇超声提取、酶法提取等，分离纯化方法有大孔树脂分离、高效液相色谱法分离等。关键词：积雪草苷 羟基积雪草苷 药理作用 提取分离前 言积雪草(Centella asiatica(L)Urban)是伞形科积雪草属植物积雪草的干燥全草，广泛分布于长江流域以南各地，具有清热利湿、解毒消肿的功效积雪草苷是积雪草中的主要活性成分，具有促创伤愈合、抗肿瘤2、抗静脉机能不全、抗溃疡3、抗抑郁4、抗炎5等多种药理活性，临床应用表明了确实的疗效6。积雪草甙和羟基积雪草甙已作为指标成分用于积雪草及其相关制品的质量控制。由于积雪草在许多药用方面都具有很高的研究价值，所以本文主要论述了近来提取分离积雪草有效成分一些方法。一、药理作用1. 1 抗氧化作用积雪草具有调节过氧化酶活性，预防氧化应激功能。其提取物不仅可以调节大脑中内源性的氧化应激损伤，而且对神经毒诱导的氧化应激也有调节作用。1. 2 抗炎作用羟基积雪草苷能减少胶原诱导性关节炎小鼠(CIA)踝关节软组织中高水平的COX 2 表达及PGE2含量，降低血浆中炎症因子TNF 和IL 6的水平，同时增加IL 10 的水平，说明羟基积雪草苷可有效的抑制CIA 小鼠炎症反应7。Liu Mei等8在研究羟基积雪草苷对CIA 的作用中发现，羟基积雪草苷可以抑制CIA 小鼠滑膜细胞增生，减轻炎性细胞浸润。此外，羟基积雪草苷可以降低血清中lgG 水平，抑制CIA 小鼠耳朵迟发性过敏反应和CII 诱导的淋巴细胞增殖反应。结果表明羟基积雪草苷对CIA 小鼠有明显的保护作用，其机制可能与调节异常细胞免疫应答有关。羟基积雪草苷为积雪草中含量较高的成分之一，可认为是积雪草治疗风湿性关节炎的主要活性成分。1.3 对皮肤系统的作用积雪草能够治疗多种皮肤病，是由于其主要成分通过增进伤口组织胶原的合成及血管生成，促进伤口愈合。积雪草苷和羟基积雪草苷是积雪草的主要活性成分。羟基积雪草苷可以减少炎性细胞的浸润，促进真皮成纤维细胞增生形成上皮。高剂量(12，24 mg /kg)的羟基积雪草苷可以降低烧伤皮肤组织中NO 和丙二醛(MDA) 含量，提高谷胱甘肽(GSH)和羟脯氨酸的水平。同时，羟基积雪草苷在体内可以促进血管生成，体外研究发现还可以刺激内皮细胞生长，从而促进伤口愈合9。低剂量的积雪草苷(10 10 10 14 w) 可以增加烧伤组织巨噬细胞内MCP 1 和IL 1 表达，从而刺激血管内皮生长因子(VEGF) 生成，加速烧伤皮肤的血管发生，促进伤口愈合10。Haftek 等研究发现，0. 1% 的羟基积雪草苷和5%维生素C 联合用药可以有效的改善皮肤老化。1.4 抗肿瘤作用在抗肿瘤方面，有研究发现积雪草提取物在体外能抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常的淋巴细胞无影响，在体内能抑制小鼠移植瘤的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期，积雪草提取物还能直接抑制DNA的合成11。另有文献报道积雪草苷对体外培养的L929和CNE细胞的增殖有抑制作用，对S180移植瘤的生长也有抑制作用同时能提高荷S180小鼠的生存时间12。黄云虹等13通过对积雪草苷抗肿瘤作用研究发现，积雪草苷能够抑制肿瘤细胞增殖，多药耐药肿瘤细胞对积雪草苷也显示出与相应非耐药细胞相似的药物敏感性，并且未见明显的交叉耐药性，并且积雪草苷还能诱导肿瘤细胞凋亡。此外，他们还发现，积雪草苷和长春新碱舍用具协同作用，积雪草苷能增加长春新碱引起的G2M期阻滞。他们通过流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳和形态学检测都证实积雪草苷与长春新碱合用后细胞凋亡明显增加。关于周期调控和凋亡相关蛋白lkl一2，caspase一3，Cyclin B1和ede2的表达分析亦证实以上结果。这种协同作用的具体机制目前尚不十分明确，他们初步认为可能为积雪草苷在诱导凋亡出现的早期，即可显著提高胞内Ca2+浓度，降低线粒体膜电位，从而影响细胞线粒体功能，这可能是积雪草苷作用于凋亡通路上的关键步骤，从而增加了细胞对抗肿瘤药物诱导凋亡的敏感性，从而与长春新碱产生协同作用。他们认为积雪草苷有可能作为生化调节刺应用于肿瘤化疗。1.5 对胃黏膜的保护作用香港CHENG等14发现，积雪草的提取物能够通过加强黏膜的自身阻碍以及减少自由基的损害来抵抗乙醇所至的小鼠胃黏膜损害，提示积雪草提取物有一定的抗胃溃疡活性。乐锦茂等发现复方积雪草浸膏治疗2周以后，大鼠血流加快，血流呈线型或线粒型，血细胞聚集减少，胃溃疡愈合面积迭995。发现积雪草浸膏对组胺所致的胃液分泌、胃液游离酸和总酸、胃蛋白酶均有一定的抑制作用。GUO等用不同浓度的积雪草水提物和积雪草苷经口服给药给乙酸诱导的胃溃疡大鼠，结果发现二者都可以在溃疡诱导后的l，3，7 d以一种剂量依赖的方式减小溃疡的面积，并发现在此过程中，溃疡组织中诱导型一氧化氮合酶的活性和蛋白表达水平降低了，在溃疡组织中硝酸盐，硝化物以及稳定的终末产物一氧化氮(nitric oxide，NO)也减少了，由此他们得出结论，即积雪草水提物和积雪草苷具有抗炎特性。并且是通过抑制NO合成从而促进溃疡的愈合。他们还发现在对溃疡的治愈过程中伴随有溃疡组织髓过氧化物酶活性的降低，以及上皮细胞增生和血管发生增加。一种重要的血管发生因子，基本的成纤维细胞生长因子在用积雪草水提取物和积雪草甙处理大鼠的溃疡组织内表达上调。这些结果进一步表明积雪草和它的活性成分做为一种抗胃溃疡药物具有广泛的应用价值。二、提取分离方法2.1 水提法积雪草含有丰富的五环三萜类化合物，如积雪草苷、羟基积雪草苷等，其中积雪草苷和羟基积雪草苷被认为具有很强的药理活性，并作为评价积雪草质量的指标。水提取2 次，第1 次加10 倍量水提取2 h，第2 次加8 倍量水提取1. 5 h。纯化工艺最佳条件为:壳聚糖用量0. 4 mL /g，药液浓缩比例1. 21，絮凝温度70 。此方法可节省原料，缩短工时，降低成本，利于工业化大生产。2.2 酶提法通过对酶的种类、用量、积雪草与溶剂水的料液质量比、酶解液初始pH、酶解温度、酶解时间等因素的综合考虑，纤维素酶与底物积雪草在质量比为1 50，料液质量比为(积雪草与溶剂水的质量比)1 25，pH 6. 0，酶解温度40 ，酶解时间1. 5 h的反应条件下所得到的积雪草苷提取产量较高。此方法反应条件温和，产率高，有利于保留有效活性成分，而且降低能耗，是比较绿色的一种提取方法。2.3 制备型高效液相色谱法利用制备型高效液相色谱从积雪草提取物中可以同时分离纯化得到积雪草苷和羟基积雪草苷两种成分，且纯度达到98% 以上15。将积雪草粗苷样品用甲醇溶解，配成浓度为40mg/mL的溶液，过0.45m微孔滤膜，采用制备型HPLC系统进行制备纯化，多次进样，收集积雪草甙和羟基积雪草甙所在部分洗脱液，减压浓缩后，置于烘箱内干燥，得到最终的产物。 2.4 AB8大孔树脂分离纯化法此方法较适合于积雪草总苷的分离纯化，各取109 AB一8大孔树脂装柱5份，在PH67下，提取液浓度在0.1g/ml或0.2g/ml时取50ml上柱，上样流速为2BV/h，先用蒸馏水洗至水澄清，再用3BV 50乙醇按2BV/h的流速进行洗脱时得到的积雪草总苷的纯度达到66以上，此方法具有操作简便，重现性好，节省能源等优点，具有一定的应用前景。结 论传统的分离方法提取得到的积雪草苷含量较低，而且含有同系的羟基积雪草苷，采用制备型高效液相色谱法和AB8大孔树脂分离纯化法可以有效的分离积雪草苷和羟基积雪草苷，并且的得到较高纯度的产品。积雪草的现代应用已经非常广泛，而作为其主要成分之一的积雪草苷基于其以上的种种特效，必将在越来越多的领域发挥其特有的优势。尽管目前对其机制的研究多数都还停留在初期阶段，但随着各项细胞和分子生物学技术在药物机制研究领域的广泛应用，相信我们对积雪草苷的认识会越来越明晰，这将为临床开发新剂型和新治疗领域提供基础。参考文献1段晓彦李宏树，王丽红，等积霉草及其活性成分的国内外研究进展J武警医学院学报200918(3)：2522552黄云虹，张胜华，甄瑞贤，等积雪草甙诱导肿瘤细胞凋亡及增强长春新碱的抗肿瘤作用J癌症，2004，23(12)：1599一16043Cheng C L，Koo M W LEffect of Centella asiatics on ethan01induced gastric mucosal lesionsin ratsJLife Sci，2000，67(21)：26474 陈瑶，秦路平，郑汉臣，等积雪草总苷对抑郁症大鼠神经内分泌功能的影响J第二军医大学学报，2002，23(11)：1224一12265 明志君，孙萌积雪草总甙抗炎作用的实验研究J中国中医药科技，2002，9(1)：626 杨璐积雪草苷药理作用及其机制的研究进展J中华中医药学刊，2008，26(1)：2152187陈瑶，韩婷，秦路平，等正交设计法优选积雪草总苷的提取工艺J中药材，2003，26(3)：2042058Li Hongzhong，Gong Xia，Zhang Li，et al. Madecassoside attenuatesinflammatory response on collagen induced arthritis inDBA/1 miceJ. Phytomedicine，2008，11，002.9 Liu Mei，Dai Yue，Yao Xiujuan. et al. Anti rheumatoid arthriticeffect of madecassoside on type II collagen induced arthritisin miceJ. International Immunopharmacology，2008，8: 1561 1566.10Yoshiyuki Kimura，Maho Sumiyoshi，Kei ichi Samukawa，etal. Facilitating action of asiaticoside at low doses on burn woundrepair and its mechanismJ. European Journal of Pharmacology，2008，584: 415 423.11SAMPSON J H，RAMAN A，KARl5EN G，el a1In vitro keratinocyteantiproliferant effect of Centella asiatica extract and tritelpenoidsaponimJPbytomedicine2001，8(3)：230-23512王瑞国，王锦菊，王宝奎，等积雪草甙抗肿瘤作用的初步实验研究J福建中医药，2001，32(4)：394013黄云虹，张胜话，甄瑞贤，等积雪草甙诱导肿瘤细胞凋亡及增强长春新碱的抗肿瘤作用J癌症