病原弧菌检测方法免疫磁珠捕获多重PCR技术的初步建立终稿毕业论文.doc

病原弧菌检测方法：免疫磁珠捕获-多重PCR技术的初步建立摘要弧菌病是由弧菌属细菌引起的细菌性疾病，给海水养殖业带来了巨大的经济损失,同时对人类健康带来巨大的威胁。本研究旨在利用免疫磁珠捕获-多重PCR技术，建立一种快速、特异性强，同时检测多种病原弧菌的技术。通过亲和层析纯化的重组外膜蛋白K（OmpK）免疫新西兰大白兔制备抗血清，利用ELISA、 Western blotting、流式细胞仪检测OmpK抗血清与弧菌及外膜蛋白的结合，结果提示OmpK为副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的交叉抗原。Sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸钠）法提取弧菌外膜蛋白，以霍乱弧菌外膜蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清，Western blotting 结果显示，霍乱弧菌外膜蛋白抗血清与多种弧菌外膜蛋白在25kDa、38kDa、40kDa、58kDa、70kDa等处有较强结合，推测弧菌间存在新的交叉抗原。通过混合引物和混合模板的PCR体系，验证了副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌5种病原弧菌的mPCR引物具有稳定性及特异性。实验结果为免疫磁珠捕获-多重PCR技术的建立提供研究基础。关键词：病原弧菌、交叉抗原、免疫磁珠分离、mPCRPrimary study of detection of pathogenic vibrios by Magnetic immuuno capture- multiple polymerase chain reaction(MIC-mPCR)AbstractVibrio is reported to be a universal marine pathogen that has caused vibriosis which bring huge economic damage to mariculture. Vibrio is also a well-known human pathogen, causing gastroenteritis through consumption of raw or undercooked seafood. Magnetic immuuno capture- multiple polymerase chain reaction (MIC-mPCR) was developed for detection of several kinds of vibrios at the same time. The recombinant outer membrane protein K were used to immunize New Zealand rabbits to obtain polyclonal antibodies. The coalescent among OmpK antibody, bacteria cell and outer membrane proteins were measured by ELISA, Western blotting and Flow Cytometry. The results indicate that OmpK is a sort of cross-reacting antigen among Vibrio parahaemolyticus, V. flurialis and V. alginolyticus. Western blot analysis of vibrio outer membrane protein with serum of V. cholerae showed that there were several cross-reacting bands in 25kDa, 38kDa, 40kDa, 58kDa and 70kDa. Its indicated that different cross-reacting antigens exist among vibrios. The multiple primer system and multiple template system were tested on 5 pathogenic vibrios, indicating the stability and specificity of mPCR primers. Key words: pathogenic vibrio, cross-reacting antigen, Magnetic immuuno capture, multiple polymerase chain reaction(MIC-mPCR).目录摘要IAbstractII目录III1.前言11.1致病弧菌的危害11.2目前国内外弧菌检测方法研究进展11.2.1免疫学方法11.2.2分子生物学方法21.3免疫磁珠捕获-mPCR弧菌检测技术31.4免疫磁珠捕获系统31.4.1弧菌主要外膜蛋白及免疫原性41.4.2交叉抗原41.5多重PCR检测系统42.实验材料52.1实验菌株52.2实验动物52.3实验试剂52.4培养基62.5仪器63.实验方法63.1外膜蛋白的提取与纯化63.1.1弧菌总外膜蛋白的提取63.1.2重组OmpK的提取与纯化73.1.3蛋白浓度的测定（Bradford法）73.2外膜蛋白的SDS-PAGE电泳73.3兔抗血清制备及效价测定83.3.1兔抗血清的制备4383.3.2抗血清效价测定83.4交叉抗原的筛选和验证83.4.1ELISA检测特异性抗体效价83.4.2免疫印迹（Western blooting）93.4.3流式细胞仪法测抗血清与弧菌的结合93.5mPCR体系设计及条件优化93.5.1引物的设计93.5.2弧菌DNA的提取103.5.3mPCR反应体系104.实验结果114.1亲和层析纯化OmpK114.2外膜蛋白浓度测定114.3弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE电泳124.4抗血清效价的测定134.5OmpK抗血清与外膜蛋白及菌体的结合144.5.1ELISA检测OmpK抗血清效价144.5.2OmpK抗血清对弧菌外膜蛋白的印迹反应144.5.3OmpK抗血清与弧菌的结合154.6Vc抗血清筛选交叉抗原174.7mPCR实验结果175.讨论与展望19致谢19参考文献：201. 前言弧菌属于弧菌科弧菌属，是一类革兰氏阴性菌，也是海洋环境中最常见的细菌类群之一1,2。由弧菌引起的细菌性疾病给海水养殖业带来了巨大的经济损失，人食用了含有致病弧菌的食品后轻则引起腹泻重则导致死亡，因此快速检测和鉴定致病弧菌能有效地控制并预防致病弧菌的传播，减少其带来的损失。目前对致病菌的检测，主要依赖于常规微生物学方法，费时费力3。近年来出现了PCR技术及荧光分析法，但由于对死菌、游离DNA的无法分辨而易导致假阳性结果的出现，而且样品中菌浓较低时易漏检。随着我国对外贸易的发展，建立一种灵敏、快速、准确的弧菌检测方法已经成为必要。免疫磁珠捕获-多重PCR技术利用致病弧菌交叉抗原制备多价抗体，结合了多价抗体的免疫磁珠能特异性地富集吸附多种弧菌，再利用多重PCR技术，一次检测多种弧菌，这将使其具有巨大的应用价值。1.1 致病弧菌的危害弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，该病在全球围内广泛发生，其暴发流行性给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业带来巨大的经济损失1,4。2002年10月，深圳盐田实验基地养殖的斜带石斑鱼发生大量死亡，经胡学峰等分离鉴定证明其为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)5。不仅如此，弧菌科细菌还是夏秋季急性腹泻的常见病原菌之一，古典生物型霍乱弧菌曾引起6次世界性大流行，我国虽不是主流流行区，但每次流行均未能幸免2。2001年5月18日，龙口市卫生防疫站从中毒病人腹泻物和剩余食物中分离鉴定出弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii) 6。黄云川等于2005年9月21日10月9日，在厦门市同安区疾病预防控制中心街道3起食物中毒报告，经调查确认为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起7。同样，位于沿海的汕头市在20042006年每年夏天对食品的致病菌检测，得到海产品的副溶血弧菌捡出率高达41.938。1.2 目前国内外弧菌检测方法研究进展传统的以培养为基础的检测方法操作复杂、特异性不强、所需时间长，而近年来发展起来的免疫学方法及分子生物学方法广泛应用于病原弧菌的检测，克服了传统检测方法的不足。目前，检测病原弧菌常用的免疫学方法主要包括血清诊断法、ELISA和免疫胶体金技术等；分子生物学方法则主要有PCR技术（多重PCR、实时荧光定量 PCR 等）和核酸杂交技术。国内外已建立了不少成熟的检验方法，并在某些国家已被官方认可，相应的试剂盒也已面世。1.2.1 免疫学方法免疫学检测基于抗原-抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合，具有特异性强、灵敏度高、易于观察、应用广泛等特点。（1）血清诊断法：目前，根据菌体抗原的不同，霍乱弧菌已分出200个以上的血清群，只有O1 群古典型(CVC) 、埃尔托型( EVC)和O139群能引起大流行。但此反应在出现新的血清型时, 如近年来副溶血弧菌出现的O3K6血清型，以现有的血清检测易漏检。（2）酶联免疫吸附检测（ELISA）：Tamplin等9建立了采用创伤弧菌特异性单克隆抗体FRBT37的酶免疫法( EIA)，该法的最低检出限为2000 个菌/孔。近年来，ELISA越来越多地用于弧菌的检测10,11，但目前ELISA对试剂要求很高，一般需提供数量较多的纯化细菌，而且很难同时分析多种成分。（3）免疫胶体金技术：其特点是单份测定、简单快速、特异敏感、不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。李宇雄12等利用胶体金法检测了环境水体中的霍乱弧菌。1.2.2 分子生物学方法（1）PCR技术聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)方法，在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。其中，依赖PCR的DNA指纹图谱技术、PCR-DGGE技术、实时荧光定量PCR检测技术、多重PCR检测技术(m-PCR)等应用最为广泛。 随机引物扩增DNA多态性(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)：Sudheesh13将RAPD 技术用于15株副溶血性弧菌和9株溶藻弧菌进行了鉴定。但是RAPD的不足之处是需对大量的随机引物进行筛选，且有时扩增的条带不很稳定。 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）：2003年，Campbell和Wright14建立了以vvhA区域为靶序列，用Taq ManR实时PCR检测创伤弧菌的方法。徐德顺等15根据副溶血弧菌gyrB基因序列设计引物和探针，实时荧光PCR检测副溶血弧菌，敏感度可达到24cfu/ml。张世英16等根据霍乱弧菌NhaA 基因保守序列，设计合成霍乱弧菌荧光定量PCR诊断试剂盒，显示其独特的优越性。 多重PCR检测技术(multiple polymerase chain reaction, mPCR)：Lee等17建立了检测纯培养物和染菌牡蛎中创伤弧菌、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）、霍乱弧菌和副溶血弧菌的多重PCR方法。mPCR 既保留了常规PCR的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂。但也存在较明显的不足：扩增效率不高、敏感性偏低；扩增条件需摸索与协调；可能出现引物间干扰等。（2）核酸杂交核酸杂交则是在基因水平进行检测,结果更为特异、准确、可靠。用于检测核酸杂交方法主要有斑点杂交、Southern杂交。 斑点杂交：Yamamoto等18针对副溶血弧菌tdh 和trh的基因设计探针，探针用碱性磷酸酶标记，进行斑点杂交检测；结果显示,tdh 、trh探针都具有高的特异性和灵敏度。但是，tdh 探针把部分弧菌科的其他细菌也检测出来，造成一定的假阳性,而且膜上核酸片段易脱落,不能长期保存。 Southern杂交：Suthienkul 等19对137 株副溶血弧菌的临床分离株进行Southern 杂交。利用地高辛标记的tdh、trh 探针，把tdh + 株(共127 株) 和trh + 株(共37 株) 全部检测出来。然而，这种方法操作繁琐、时间长，不适合临床实验室的快速检测。1.3 免疫磁珠捕获-mPCR弧菌检测技术目前常用的培养检测法只适应于那些可以培养的微生物，有些微生物是活的，但在实验室中较难培养，也有些处于不可培养状态。聚合酶链反应(PCR) 技术灵敏度高，可以检测可培养的微生物、活的而不能培养的微生物、死的微生物或微生物细胞外的DNA 等。但是常规的PCR技术在实际的微生物检测过程中存在诸多的缺陷，例如样品中的死菌、游离DNA导致假阳性结果，样品成分复杂时较难分离提取DNA，而且在成分复杂的样品中可能存在一些抑制因子对微生物的裂解、核酸变性、DNA聚合酶活性造成影响。即使是近来出现的实时荧光PCR也存在其不足之处。免疫磁珠捕获-mPCR 技术利用免疫反应的特异性，固定于某种介质表面的抗体特异识别细菌、病毒等微生物及其可溶性抗原，并形成抗原抗体复合物，从而将病毒或细菌从标本的复杂成份中分离出来，制备核酸模板用于 PCR 扩增的后续检测分析。Chen J等20利用磁捕获PCR 法(Magnetic Capture Hybridization Polymerase Chain Reaction, MCH-PCR)检测沙门氏菌（Salmonella）、产志贺样毒素的埃希氏大肠杆菌(SLTEC),结果表明不管是沙门氏菌的单独MCH-PCR，还是沙门氏菌与产志贺样毒素的大肠杆菌的多重MCH-PCR都能特异地检测出来。刘光明等21建立磁捕获-荧光聚合酶链式反应( Immunomagnetic Capture Fluorescent Polymerase Chain Reaction,IMC-FPCR) 检测方法,可在24 h 内完成样品中活的非可培养状态”(Viable but Nonculturable, VBNC)空肠弯曲菌的检测，特异性好，检测低限达到10cfu/ml。免疫磁珠捕获-PCR 技术结合了免疫分离的特异性和 PCR 扩增的高效性，操作简便、快捷，设备和操作要求不高，使许多繁琐的操作简便化，缩短检测分析过程，节省大量细菌、病毒分离的繁琐工作步骤和时间，极大提高检验工作效率，在微生物检测中具有广泛的应用前景。1.4 免疫磁珠捕获系统免疫磁珠由载体微球和免疫配基结合而成，核心为金属小颗粒，核心外包裹一层高分子材料，最外层是功能基层，能结合不同的免疫配基。免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic Beads Separation Techniques, IMBS） 将免疫学特异反应与磁力吸附结合起来，对微生物进行分离的一种方法。基本原理是利用人工合成的内含铁成分，可被磁力吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质（抗体）的磁珠，作为抗体的载体22。当免疫磁珠与抗原结合时，就会形成免疫磁珠-抗原复合物，这个复合物在磁场的作用下朝一定方向移动，从而富集抗原，因此可以利用免疫磁珠富集食品或环境中有害微生物。张凡非23等利用免疫磁珠分离法分离海水、海泥及哈肉中的副溶血弧菌，结果发现未经免疫磁珠处理的样品，TDH（耐热直接溶血毒素）阳性株的分离率比磁珠处理样品明显偏低，表明免疫磁珠处理能提高检出率。在这个系统中，通过抗体同时捕获多种弧菌，因此需要从具有免疫原性的外膜蛋白中筛选能制备这种多价抗体的交叉抗原。1.4.1 弧菌主要外膜蛋白及免疫原性外膜蛋白（Out membrane protein, OMP）是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，位于细胞壁的表层，易被宿主的免疫系统识别，是一种能保留免疫原性且副作用较小的亚单位疫苗 24。研究表明细菌主要外膜蛋白含量丰富，免疫原性强，是重要的保护性抗原，可对不同血清型菌株的感染产生交叉保护25。目前已经对多种病原弧菌的外膜蛋白有了较多的研究，其中主要的有外膜蛋白A（Out membrane protein A,OmpA）、外膜蛋白U（Out membrane protein U,OmpU）、外膜蛋白W（Out membrane protein W,OmpW）及外膜蛋白K（Out membrane protein K,OmpK）等。OmpA分子量约为68kDa，主要为包涵体形式。OmpA除了与细菌的膜稳定性及侵袭性有关外，还可通过Toll like receptor 激活抗原提呈细胞并释放相关的免疫活性因子，以激发免疫系统产生特异性和非特异性的免疫26。霍翠梅27、周祖涛28等的研究也表明OmpA具有免疫原性。OmpU为等电点3.6的酸性蛋白，由38kDa的单体构成同型三聚体。OmpU是霍乱弧菌中含量最丰富外膜蛋白，被认为是霍乱弧菌重要保护性抗原29。同时，李小飞等的研究也表明OmpU是拟态弧菌的保护性抗原之一30。OmpW分子量约为21kDa，在细菌性感染中为一主要抗原。霍乱弧菌的OmpW基因早在1990年已被克隆到，可用于霍乱弧菌的快速鉴定，它的蛋白具有强免疫原性31。OmpK分子量为28kDa，广泛存在于各种弧菌中，是弧菌细胞表面一种组成性蛋白，在感染和诱导宿主免疫反应的过程中起重要作用32,33。李宁求等34的研究表明，哈维氏弧菌的OmpK具有较强的免疫原性，可能是弧菌的一种保护性抗原。1.4.2 交叉抗原交叉抗原又叫共同抗原，是指不仅能和它本身经免疫反应得到的抗体结合，还能与其它抗体结合的抗原。唐小千35等对6种海洋致病弧菌36kDa外膜蛋白进行SDS-PAGE、双向电泳分析，再通过Western-blot、ELISA测定鼠抗鳗弧菌SJ060621的36kDa外膜蛋白血清与6种弧菌36kDa外膜蛋白的结合，结果提示该外膜蛋白是弧菌的一种交叉抗原，为筛选制备海洋致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗提供参考。吴淑勤34等对19株弧菌OmpK基因进行序列分析表明，OmpK基因间碱基序列相似性较高，从分子水平推测OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等鱼类致病弧菌的共同抗原。1.5 多重PCR检测系统多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系中加上两对及以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。许龙岩等36以霍乱弧菌O139特异基因T139、ctxA、tcpA，副溶血性弧菌热稳定性直接溶血素基因tdh为靶序列,建立了可同时检测食品中O1群、O139群霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR方法。dnaJ基因是微生物中高度保守的一种看家基因，能作为分支杆菌37、军团杆菌38及链球菌39 等微生物的鉴定分子标记。Pham Hong Nhung等40通过57株标准弧菌和22株临床弧菌的dnaJ序列、16SrRNA全基因及其它看家基因 (recA，rpoA，hsp60) 的序列同源性分析，发现在不同弧菌中dnaJ基因比recA、rpoA基因相似性更低，基于dnaJ基因的序列分析，能区别鉴定几乎所有的弧菌，利用dnaJ基因设计引物的mPCR能一次性检测多种弧菌。2. 实验材料2.1 实验菌株表1 实验菌株菌种（Species）来源（Source）霍乱弧菌（Vibrio cholerae,Vc）Vb0副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）VPL4-90副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）ATCC 17802溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，Val）ATCC 33787拟态弧菌（Vibrio mimicus，Vm）ATCC 33653创伤弧菌（Vibrio vulnifgicus，Vv）ATCC 27562河弧菌（Vibrio flurialis，Vf）ATCC 33810弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii，Vfu）ATCC 33813大肠杆菌DH5（E.coli DH5）实验室保藏2.2 实验动物健康的雌性新西兰大白兔，体重约2Kg，从医学院实验动物中心购买。2.3 实验试剂Ni-NTA缓冲液1：50mM，pH 7.4 PBS：0.5M NaH2PO4 19ml、0.5M Na2HPO4 81ml、Nacl 29.3g，加水溶解后定容至1000ml；Ni-NTA缓冲液2：50mM，pH 7.4 PBS：0.5M NaH2PO4 19ml、0.5M Na2HPO4 81ml、Nacl 29.3g、咪唑34g，加水溶解后定容至1000ml；Ni-NTA 20mM咪唑浓度缓冲液3：96ml缓冲液1加4ml缓冲液2；Ni-NTA 50mM咪唑浓度缓冲液3：90ml缓冲液1加10ml缓冲液2；Ni-NTA 100mM咪唑浓度缓冲液3:80ml缓冲液1加20ml缓冲液2；TBS：2.4228g Tris，8.775gNacl，加水溶解后定容至1L，Hcl调pH至7.4；TTBS：含0.5% Tween-20的TBS；封闭液：含5%脱脂奶粉的TTBS；DAB：5mgDAB，4mgNicl，10ml的0.05M Tris-cl，5l的30% H2O2；柠檬酸盐缓冲液：0.47g柠檬酸，1.84g Na2HPO412H2O，加水调pH至5.0，定容至100ml；TMB：1 mg TMB，9.0 ml柠檬酸盐缓冲液，20l的30% H2O2。2.4 培养基LB培养基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g 酵母提取物，10.0 g 氯化钠，1000 ml蒸馏水，pH7.0；121C灭菌20 min。LB琼脂培养基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g 氯化钠，1000 ml蒸馏水，15.0 g琼脂粉pH7.0；121C灭菌20 min；倒平板后常温静置12天蒸发水分。肉汤培养基：5.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0g氯化钠，1000ml蒸馏水，pH7.0；121C灭菌20 min。TCBS琼脂培养基：5.0 g酵母膏粉，10.0 g蛋白胨，10.0 g氯化钠，10.0 g柠檬酸钠，10.0 g硫代硫酸钠，10.0 g胆酸钠，5.0 g牛胆粉，20.0 g蔗糖，1.0 g柠檬酸铁，15.0 g琼脂，0.04 g溴麝香草酚兰，0.04 g麝香草酚兰，1000 ml蒸馏水，pH8.60.2；搅拌加热煮沸至完全溶解，煮沸勿超过2min，勿高压灭菌；倒平板后常温静置12天蒸发水分。2.5 仪器T-Gradient PCR仪（德国“Biometra”公司），Centrifuge 5417R台式高速离心机（德国“Eppendorf”公司），BioPhotometer生物分光光度计（德国“Eppendorf”公司），DYY-2稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），Gene Genius凝胶成像系统（英国“Syngene”公司），电热恒温培养箱（上海福玛试验设备有限公司），恒温培养摇床（上海福玛试验设备有限公司），无菌操作台（苏州净化设备厂），手提式压力灭菌器（上海博迅实业有限公司），KD-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司），电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），DEL- TA320 pH计（瑞士“Mettle Toledo”公司），79-2磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司），XW-80A漩涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司），薄膜塑料封口机（温州市兴业机械设备有限公司），Jim-X电转仪，BD FACSAria流式细胞分选仪，2K-630 大容量低速冷冻离心机（Beckman公司）。3. 实验方法3.1 外膜蛋白的提取与纯化3.1.1 弧菌总外膜蛋白的提取41菌种扩培后6000rpm,5min收集菌体；0.9%生理盐水洗涤沉淀两次；0.02M Tris-cl，pH7.5重悬细胞沉淀；200w，20min超声破碎；6000rpm，10min收集上清；42000rpm，4，离心10min（BECKMAN离心机，转子类型r=108.5mm）；2%月桂酰基基胺酸钠重悬沉淀，室温静置40min；42000rpm，4，离心10min；沉淀用0.02M Tris-cl，pH7.5重悬；-20保存。3.1.2 重组OmpK的提取与纯化42将实验室现有的含重组质粒pET-32a-OmpK的E.Coli Rosetta活化并挑单菌于含有0.05 mg/ml氨苄青霉素（Amp）的新鲜LB培养基中37摇床培养至对数生长末期，加1mM IPTG诱导3-4h；8000rpm离心收集菌体，生理盐水洗涤两次；加Ni-NTA缓冲液1重悬菌体；400w超声破碎20min，12000rpm离心5min；0.45微米的针头滤器过滤；上样到由缓冲液1平衡过的Ni-NTA亲和层析柱；缓冲液2洗脱亲和层析柱，收集穿透液；先后用不同咪唑浓度的缓冲液3洗脱，分别收集洗脱液；按洗脱液/丙酮=1/5(体积比)在20 mM、50 mM、100 mM咪唑浓度的洗脱液中加入丙酮，沉淀蛋白；离心，吹干丙酮，加少量PBS溶解。3.1.3 蛋白浓度的测定（Bradford法）实验按常规方法进行。牛血清蛋白(BSA) 标准曲线的制作：取6支试管，编号为1-6，按下表2加入试剂，混匀后静置2min，以1号管做空白对照，测定各管在595 nm下的吸光值，并以吸光值为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线；取未知样品溶液，经适当稀释（使吸光值控制在标准曲线范围内）后加入G-250染色液5ml混匀，测其在595 nm下吸光值，对照标准曲线求出未知蛋白浓度。表2 Bradford法测蛋白浓度的标准曲线制作试管号123456标准蛋白溶液/ml00.150.30.450.60.75蒸馏水/ml10.850.70.550.40.25每管中所含蛋白量/g01530456075G-250染色液/ml5555553.2 外膜蛋白的SDS-PAGE电泳1) SDS不连续系统板状凝胶的制备表3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶配制成分水30% Acr-Bis1.5MTris1.0MTris10%SDS10%过硫酸铵TEMED12%分离胶15ml4.963.800.150.150.0065%浓缩胶5ml3.40.8300.630.050.050.005按说明书安装玻板，确定凝胶体积及凝胶浓度，1.5%琼脂封玻板两边及底面。按表3配制分离胶及浓缩胶，灌浓缩胶后加异丙酮封胶，待胶凝后倒出异丙醇，用去离子水清洗凝胶顶部数次，再用纸巾吸净残留的水。灌注浓缩胶，立即插入干净的梳子，注意不要产生气泡，静置待胶凝。2) 蛋白质样品的预处理根据外膜蛋白的浓度，每孔上样量80g，计算蛋白样品的上样体积，样品分别与等量2SDS上样缓冲液混匀，100水浴2min。3) 加样在垂直板型电泳装置的上下槽内，分别加电极缓冲液，上槽内的缓冲液必须灌满加样孔。用微量注射器依次加样，每次加样后都需冲洗注射器34次。4) 电泳上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源。样品进入分离胶前，将电压调至70V；进入分离胶后，电压调至110V，保持电压不变。待指示染料迁移至下沿1cm处停止电泳。5) 剥胶、染色、脱色电泳结束后，取下凝胶板，用镊子将短板玻璃撬开，水轻轻冲洗胶面。用注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与玻板之间，一边注水，一边推针前进，使凝胶与板脱离。凝胶脱离后，加入染色液染色15min。染色完毕，倒出染色液，加入脱色液。脱色23次，直至凝胶蓝色背景清晰为止。3.3 兔抗血清制备及效价测定3.3.1 兔抗血清的制备43取蛋白（霍乱弧菌总外膜蛋白，重组外膜蛋白K）作为抗原，各加1.0ml（含0.25-0.5mg蛋白）与等量弗氏完全佐剂（CFA）混合均匀，在新西兰大白兔背部两侧、耳后等多处进行皮下注射；2周后，按同样方法进行加强免疫（抗原量减少一半，且用弗氏不完全佐剂混匀）；10天后，进行第二次加强免疫；2周后，进行第三次加强免疫。在第三次加强免疫后的第10天，兔耳采血清测效价。兔血室温静置凝固后，4放置4h，2000rpm离心10min得血清，-20保存备用。3.3.2 抗血清效价测定在Sambrook J44等的研究基础上稍作改进，用Dot-ELISA法检测兔抗血清效价。剪NC膜，用0.01M PBS（pH7.4）浸泡5min（若为PVDF膜则先用甲醇活化5s）；晾干后用稀释的蛋白样品点样2l ；自然晾干后加封闭液摇床封闭1h；TBS洗涤三次，每次5min；加入稀释的抗血清室温摇床孵育2h；TTBS洗涤三次，每次10min；将NC膜转移至用封闭液稀释的1/500羊抗兔IgG-HRP中，室温摇床孵育1h；TTBS洗涤三次，每次10min；DAB显色，拍照，保存。3.4 交叉抗原的筛选和验证3.4.1 ELISA检测特异性抗体效价ELISA检测按照常规方法进行。8000rpm，5min离心收集菌体，生理盐水洗涤两次，1ml Coating Buffer悬浮，稀释成五个梯度；96孔板酶标板上以上述抗原包被，每孔加100l，每个浓度做三个平行，37静置60min；吸除样液后每孔加200l封闭液，37，1h；自动洗板机用TTBS洗涤，100l每孔，洗涤五次；加适当浓度一抗，100l每孔，37，1h；自动洗板机用TTBS洗涤，100l每孔，洗涤五次；加适当浓度二抗，100l每孔，37，1h；自动洗板机用TTBS洗涤，100l每孔，洗涤五次；加显色剂TMB,100l每孔，37，45min；加2M H2SO4终止反应，测OD450，记录数据。3.4.2 免疫印迹（Western blooting）SDS-PAGE电泳后，将胶切好，并良好胶面积，剪同样大小的滤纸和PVDF膜；PVDF膜在甲醇中活化5s，同滤纸一起放入电转缓冲液中浸泡10min；按顺序铺好滤纸、PVDF膜及胶，赶走气泡；半干式电转槽按0.6-1.0mA/cm2，电转3h；TBS洗涤三次，每次5min；膜用封闭液封闭1h；取出PVDF膜，放入少量TBS浸泡5min，反复三次；加入稀释的一抗，室温孵育2h；TTBS洗涤三次，每次10min；加入稀释的二抗，室温孵育2h；TTBS洗涤三次，每次10min；DAB显色，出现条带即用水冲洗。3.4.3 流式细胞仪法测抗血清与弧菌的结合参照Ramani45、Pina-Vaz46及张哲47等的方法，8000rpm离心收集扩培至对数生长期的菌体，生理盐水洗去培养基；0.05%甲醛重悬菌体，室温处理30min；加TBS洗涤菌体三次；1ml TTBS重悬菌体，离心出去上清；加入稀释的抗血清(一抗)，孵育2h；TTBS洗涤三次；加入稀释的FITC标记IgG 1ml，避光摇床孵育1h；TTBS洗涤三次；上机检测，吸收波长492nm，激发波长520nm。同时设置对照，对照组不加一抗，其余方法步骤同上。实验组设计三个平行组。3.5 mPCR体系设计及条件优化3.5.1 引物的设计采用Pham Hong Nhung40等基于dnaJ基因设计的mPCR特异性引物（表4），检测副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌五种病原弧菌。表4 五种弧菌的引物Target species Primer Sequence (5 3) Tm (C) Products(bp) VM-F CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 73.2 V. cholerae VC-Rmm AGCAGCTTATGACCAATACGCC 66 375 V. parahaemolyticus VP-MmR TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG 67.7 96 V. vunificus VV-Rmm GTACGAAATTCTGACCGATCAA 62.7 412 V. mimicus VM-Rmm YCTTGAAGAAGCGGTTCGTGCA 71 177 V. alginolyticus Val-MmR GATCGAAGTRCCRACACTMGGA 62 144 3.5.2 弧菌DNA的提取488000rpm离心收集菌体（20ml），生理盐水洗涤两次；5ml提取液悬浮菌体，100，2min，冷却后12000rpm，4离心15min，收集上清；加入0.6倍体积酚/氯仿/异戊醇=25/24/1,12000rpm，4离心15min，收集上清；加入0.6倍体积氯仿/异戊醇=24/1,12000rpm，4离心15min，收集上清；加入1/10体积3M、pH 5.2 NaAc及2倍体积无水乙醇，-20，30min；12000rpm，4离心15min，沉淀用75%乙醇洗涤，离心去上清，室温干燥，加入TE溶解后-20保存备用。3.5.3 mPCR反应体系实验中分别使用混合引物体系和混合模板体系，检验mPCR引物的稳定性和特异性。在混合引物体系中，将Vp、Vc、Val、Vv、Vm的下游引物与上游引物等量混匀，制成混合引物；在混合模板体系中，将Vp、Vc、Val、Vv、Vm的DNA等量混匀，制成混合模板。每个体系均加有7.5l的2Taq PCRmix，其中混合模板体系再加有1l的混合模板，1l的上/下游引物，其余用ddH2O补够15l；混合引物体系再加游1l混合引物，1l模板，其余用ddH2O补够15l。PCR反应条件为：95预变性3min；94变性30s，60退火30s，72延伸1min，30个循环；72延伸10min。4. 实验结果4.1 亲和层析纯化OmpK将提取到的蛋白经镍柱上样、洗脱、收集，洗脱图见图1。收集各组分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果如图2。图1 纯化蛋白不同咪唑浓度洗脱液的洗脱峰其中第1个峰为穿透液，第2、3、4个峰分别为20mM、50mM、100mM咪唑浓度洗脱液18KD 38KD 58KD 75KD M 1 2 3 4 5 图2 镍柱洗脱液SDS-PAGE电泳图其中泳道1为上样液，泳道2为穿透液，泳道3、4、5分别为20mM、50mM、100mM咪唑浓度洗脱液。从图1、图2可知，上样液中含有大量的OmpK，经镍柱后结合到功能基团上，穿透液中几乎不含OmpK；20mM咪唑浓度洗脱液洗掉大部分的杂蛋白，当洗脱液咪唑浓度为50mM和100mM时，OmpK被洗脱下来。4.2 外膜蛋白浓度测定Bradford法测定8种外膜蛋白浓度，标准蛋白吸光值如表5，标准曲线如图3 。表5 Bradford法测蛋白浓度的标准曲线制作试管号123456标准蛋白溶液/ml00.150.30.450.60.75水/ml10.850.70.550.40.25每管中所含蛋白量/g01530456075G-250染色液/ml555555A59500.090.2020.280.3540.428图3 Bradford法测蛋白浓度标准曲线八种外膜蛋白中Vp、Vc、Vm、Val稀释100倍测得吸光值为0.366、0.479、0.363、0.151，Vpl4-90、Vf、Vfu、Vv稀释200倍测得吸光值为0.156、0.184、0.242、0.128，对照标准曲线，得到Vp、Vpl4-90、Vc、Val、Vv、Vm、Vf、Vfu的浓度分别为（单位mg/ml）6.2、5.1、8.2、2.5、4.1、6.2、6.1、8.1。4.3 弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE电泳图4 八种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE电泳图电泳结果显示（图4），八种弧菌所在的泳道均出现了多条条带。但据毛芝娟等人报道，副溶血弧菌外膜蛋白的电泳时一般只出现56条条带，究其原因可能是上样量过大，导致非主要外膜蛋白显色明显，因为SDS-PAGE电泳的上样量一般为1520g，而本实验所用到的上样量为80g。4.4 抗血清效价的测定抗血清效价测定时以0.1mg/ml BSA为阴性对照。OmpK、霍乱弧菌外膜蛋白用PBS按1：5、1：25、1：125稀释；一抗用封闭液按1：50、1：200、1：800稀释。经DAB显色后，结果如图5、图6所示。BSA1:11:51:251:1251:501:2001:800图5 Dot-ELISA法测定OmpK 兔抗血清效价BSA1:11:51:251:1251:501:2001:800图6 Dot-ELISA法测定霍乱弧菌外膜蛋白兔抗血清效价从图5、6可见，BSA的斑点免疫印迹，实验结果无杂交斑点出现，表明BSA与OmpK、Vc外膜蛋白的抗血清无免疫识别作用。在实验组中，当抗体稀释为1：800、抗原稀释为1：125时，图5、6仍然出现比较明显清晰的斑点，表明两种抗血清的效价较高，已经符合实验需要。4.5 OmpK抗血清与外膜蛋白及菌体的结合4.5.1 ELISA检测OmpK抗血清效价以=570nm测定弧菌浓度，=420nm测定DH5菌体浓度，两组均以0.9% Nacl为空白对照。测量时菌体400l加入3ml 0.9%Nacl中稀释。在做ELISA实验时，7ml菌体离心后用1ml Coating Buffer悬浮，取90l加到410l Coating Buffer中混匀作为10-1，再从10-1中取出90l加到410lCoating Buffer中混匀作为10-2，依次稀释至10-5。完全稀释混匀后每个浓度做三个平行，每孔加入100l。所得结果如图7所示。图7 OmpK抗血清与弧菌的结合由图7可知，Vp、Vpl4-90、Val、Vf与OmpK抗血清的结合效价较高，但与对照组相比差异不显著。所有实验组的吸光值均较小，推测原因可能是二抗稀释度过大、孵育时间短；实验组与对照组差异小，且随孵育时间的增加，阴性值增加，所以实验组与对照组差异小不仅仅是由上述两个原因造成的，实际可能由于一抗含有除OmpK以外的抗血清。4.5.2 OmpK抗血清对弧菌外膜蛋白的印迹反应SDS-PAGE电泳完后，以PVDF膜转膜，进行Western blotting，以OmpK抗血清作为一抗进行孵育，经显色后结果如图8所示。75KD18KD38KD58KDM Vp Vpl4-90 Vc Val Vv Vm Vf Vfu图8 OmpK抗血清的Western Blotting由图8可知，Vp、Vpl4-90及Val与OmpK抗血清在28kDa的位置有较强结合，OmpK的分子量约为28kDa，因此推测Vp、Vpl4-90及Val的外膜蛋白K是交叉抗原。此外，图8也出现了许多其它条带，推测可能的原因有两个。其一，抗血清不纯。含有除OmpK抗血清以外的抗血清，与之对应的外膜蛋白结合而出现多个条带；其二，是一抗可以与OmpK以外的蛋白非特异性结合，出现多个条带。4.5.3 OmpK抗血清与弧菌的结合FITC标记的二抗（1：1000稀释）与一抗（1：500稀释）结合，经过流式细胞仪后，软件处理得到的图像如图10。图9 流失细胞仪测定OmpK抗血清与细菌的结合由图9可知Val、Vf、Vp与OmpK抗血清的结合较强，而Vpl4-90的结合较弱，DH5与抗血清也有一定的结合。由此推测带有OmpK抗血清的免疫磁珠可以用来捕获Val、Vf、Vp。由于OmpK基因是从副溶血弧菌中获得的，OmpK的抗血清应该与Vpl4-90结合较强，而实际上结合却较弱，可能原因尚待进一步研究。从图10可知，实验组相对于对照组荧光强度增加，其中Vf的实验组与对照组相比， FITC值显著增加；大肠杆菌DH5实验组相对于对照组而言荧光强度也有所增加。推测Vf与OmpK抗血清有较强的结合，而大肠杆菌菌DH5与OmpK抗血清有一定的结合。 图10 流式细胞仪荧光激发图4.6 Vc抗血清筛选交叉抗原SDS-PAGE电泳完后，以PVDF膜转膜，进行Western blotting，以Vc外膜蛋白抗血清进行孵育，经显色后结果如图11所示。M Vp Vpl4-90 Vc Val Vv Vm Vf Vfu75KD58KD38KD18KD图11 Vc外膜蛋白的Western Blotting由图11可得，除Vv外，几乎所有的弧菌外膜蛋白均有显色条带出现，而且条带数多，特别是在25kDa、38kDa、40kDa、58kDa、70kDa位置处多种