绿茶多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠治疗机制研究的设计书.doc

绿茶多糖对型糖尿病小鼠治疗机制研究的设计书第一部分 文献综述1.糖尿病1.1全球糖尿病的现状与流行趋势 按照世界卫生组织（WHO）及国际糖尿病联盟（IDF）专家组的建议，糖尿病可以分为型、型、其他特殊类型及妊娠糖尿病4种。近年来，随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率及患病率逐年升高，已成为威胁人民健康的重大社会问题，引起各国政府、卫生部门、广大医务工作者以及相关科研人员的的关注和重视。 型糖尿病患病率远低于型糖尿病。由于儿童型糖尿病的发病症状一般较为明显，不易漏诊，故多数学者主张用发病率来描述型糖尿病的流行病学特点 医学教育网整理发布。据现有资料分析，世界不同地区型糖尿病的发病情况差异甚大，以北欧国家最高，而东南亚国家则相对较低。近年来，世界各地型糖尿病发病率有逐年增高的趋势，但增高速度远不及型糖尿病。欧洲国家型糖尿病发病率有自南向北逐渐升高的趋势。型糖尿病发病率与季节和病毒性疾病流行相一致，这提示型糖尿病的发病可能于病毒感染有关。中国是世界上型糖尿病发病率最低的国家之一，但由于中国人口基数大，故型糖尿病患者的绝对例数并不少。据国内估计，目前我过型糖尿病患者总数在200万300万。型糖尿病起病时症状比较隐蔽，很难在初发时即获确诊，但其患病率较高。一般用患病率对型糖尿病的流行病学特点进行研究。近年来，世界各国型糖尿病的患病率均有急剧增加的趋势，型糖尿病患者激增是造成全世界糖尿病患者总数剧增的主要原因。据20世纪80年代以来WHO报告的结果，世界各国型糖尿病患病率的变化有以下共同特点：1、患病率急剧增加，近三五十年内型糖尿病急剧增加的趋势仍难以缓解。WHO预测的结果如下：1994年糖尿病患者人数为1.20亿,1997年为1.35亿,2000年为1.75亿,2010年为2.39亿，2025年将突破3亿。目前世界糖尿病患者人数最多的前3位国家为印度、中国、美国；2、型糖尿病是糖尿病人群的主体。型糖尿病占糖尿病患者的90%左右，我国型糖尿病所占比例也是如此；3、发病年龄年轻化。不少国家儿童型糖尿病已占糖尿病儿童的50%80%，儿童型糖尿病 问题以引起人们的极大关注；4、存在大量血糖升高但未达到糖尿病诊断标准者。他们的空腹血糖、餐后2小时血糖或服糖后2小时血糖介于正常血糖与糖尿病诊断标准之间。目前糖尿病学界倾向于把这类人称为糖调节受损（impaired glucose regulation,IGR）者。糖调节受损者是糖尿病患者的后备军，他们的大量存在，预示着糖尿病爆发性流行的趋势还在继续发展；5、各地发病状况差异巨大。世界各国型糖尿病的患病率有很大差异，从不足0.1%直至40%。患病率最高的地区是太平洋岛国瑙鲁(Nauru)和美国皮玛(Pima)印地安人。发病率增加最快的是由穷到富急剧变化着的发展中国家。其他特殊类型糖尿病是指既非型或型糖尿病，又与妊娠无关的糖尿病，包括胰腺疾病或内分泌疾病引起的糖尿病、药物引起的糖尿病以及遗传疾病伴有的糖尿病等。其他特殊类型糖尿病虽然病因复杂，但占糖尿病患者总数不到1%。其中，某些类型的糖尿病是可以随着原发疾病的治愈而缓解的。妊娠糖尿病是指妊娠期间发生或者发现的糖尿病。妊娠是糖尿病的高发时期，妊娠糖尿病的发病率远远超过人们的估计，而且对母子的平安构成威胁，故虽然妊娠糖尿病的转归一般较好，还是应该对这类状况予以足够的重视。1.2 型糖尿病的发病机制大量研究已显示，人体在高血糖和高游离脂肪酸（FFA）的刺激下，自由基大量生成,进而启动氧化应激。氧化应激信号通路的激活会导致胰岛素抵抗（IR）、胰岛素分泌受损和糖尿病血管病变。由此可见，氧化应激不仅参与了型糖尿病的发病过程，也构成糖尿病晚期并发症的发病机制。氧化应激与糖尿病相互促进,形成一个难以打破的怪圈。 胰岛素抵抗可以先于糖尿病发生,在其作用下，疾病早期胰岛素代偿性分泌增加以保持正常糖耐量。当胰岛素抵抗增强、胰岛素代偿性分泌减少或二者共同出现时，疾病逐渐向糖耐量减退和糖尿病进展，血糖开始升高。高血糖和高FFA共同导致ROS大量生成和氧化应激，也激活应激敏感信号途径，从而又加重胰岛素抵抗，临床上表现为糖尿病持续进展与恶化。体外研究显示，ROS和氧化应激可引起多种丝氨酸激酶激活的级联反应。最近的抗氧化剂改善血糖控制试验也证实，ROS和氧化应激会引起胰岛素抵抗。 细胞也是氧化应激的重要靶点 细胞内抗氧化酶水平较低，故对ROS较为敏感。ROS可直接损伤胰岛细胞，促进细胞凋亡，还可通过影响胰岛素信号转导通路间接抑制细胞功能。细胞受损，胰岛素分泌水平降低、分泌高峰延迟，血糖波动加剧，因而难以控制餐后血糖的迅速上升，对细胞造成更为显著的损害。1.3治疗方法1.3.1药物治疗近年来型糖尿病的新药研究进展迅速。如肠促胰素相关药物、葡萄糖激酶激活剂、肾脏钠-萄糖转运子2(sodium dependent glucose transporter 2 ,SGL T2)抑制剂、抗IL-1抗体等。其中肠促胰素相关药物的研究进展最快,胰升血糖素样肽-l (GLP-1)类似物和DPP-4 抑制剂两类药物具有良好的前景,动物和临床试验显示了两类药物的独特性能,有多方面的降糖作用。Defronzo 等通过对型糖尿病的病理生理机制进行分析后提出,型糖尿病发病不仅存在胰岛细胞的胰岛素分泌缺陷、肌肉组织葡萄糖摄取减少以及肝糖输出增加等方面的异常,外周组织器官也参与了糖尿病的病理生理过程。脂毒性、肠促胰素减少、胰升糖素不适当增加、肾近曲小管细胞SGL T2 表达异常以及中枢神经递质的功能失常等使治疗型糖尿病需要多种药物联合以纠正多种病理生理缺陷,因此,他们对首次诊断为 型糖尿病患者提出了新的治疗模式,即调整生活方式+ 三种药联用(TZD + 二甲双胍+ GLP-1) 。新模式的主要目的是保护细胞,无低血糖和无体重增加风险,可使血糖长期维持在理想范围。1.3.2手术治疗2009 年ADA 指南中增加了关于肥胖的糖尿病患者可以考虑胃手术治疗,这是因为有不少证据提示明显肥胖的糖尿病患者手术治疗后血糖可得到显著改善,甚至可以达到临床治愈,这为肥胖型糖尿病患者带来了新的希望。对BMI 35kg/ m2 的成年型糖尿病患者,特别是通过改变生活方式结合药物治疗难以控制血糖者,可考虑施行胃手术;对BMI 介于3035kg/ m2 的型糖尿病患者的血糖控制可能有益,但缺乏证据。目前胃手术给型糖尿病患者带来的长期益处、其效益和风险比以及手术自身的风险等问题,需要通过与以药物和生活方式相结合的最佳治疗方案进行随机对照试验来验证。1.4临床表现颈动脉系统脑血管病特点：占糖尿病脑血管病的6080左右，其中以缺血性脑血管病多见，占约90左右。中小梗塞（直径小于2mm）比大梗塞者多见，多发性脑梗死发病率高，有报道达70左右。病变范围广泛，尤以基底节区血管损害最多见，占颈动脉系统总数的80，病灶形态多数呈圆形或类圆形，部分呈小囊形、楔形及不规则形，散在分布在基底节及侧脑室旁白质区域。意大利Cazzato等报道糖尿病的脑梗死以大脑皮质和皮质下梗死为多见。大多数病灶密度不均匀，以低密度为主，CT值介于15Hu25Hu，糖尿病脑梗塞病灶的CT值比非糖尿病脑梗塞平均低8Hu。梗塞常易反复发生，无临床症状的脑梗塞多见，临床常无神经系统定位体征。可能与脑血管病变的广泛及血液流变学改变有关。急性颈内动脉系统脑血管病发病约占1030左右，主要表现为颈内动脉、大脑中动脉及其分支的病变，表现为偏瘫、失语、偏侧感觉障碍等。临床观察发现，糖尿病脑血管病常表现为进展性卒中，肢体力量持续下降，意识障碍加深，血糖持续升高。2.绿茶多糖的简介2.1绿茶多糖绿茶是指采取茶树新叶，未经发酵，经杀青、揉拧、干燥等典型工艺，其制成品的色泽，冲泡后的茶汤较多的保存了鲜茶叶的绿色主调。绿茶茶叶为山茶科植物茶的芽叶，其药用历史悠久。从原料老嫩看，老叶含量比嫩叶多。同种茶类级别低原料老，含量相对高。绿茶多糖是一种酸性糖蛋白,并结合有大量的矿质元素，称为茶叶多糖复合物，简称为茶叶多糖或茶多糖（Tea Polysaccharide）。其上蛋白部分主要由约20种常见的氨基酸组成，糖的部分主要由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等，矿质元素主要由钙、镁、铁、锰等及少量的微量元素，如稀土元素等组成，其分子量约为107000-114000。 绿茶多糖粗品在8590热水中的溶解度为76%。其水溶液呈浅褐色透明半稠状。该溶液与硫酸蒽酮、硫酸苯酚反应呈阳性。绿茶多糖不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。 绿茶多糖对热稳定性较差，表现在其水溶液随干燥温度增高，色泽变深，其中部分成分在高温下发生氧化。而且在热的作用下，糖类物质会发生降解，使多糖含量降低。在碱性条件下，茶多糖水溶液颜色加深且随碱性提高而加剧，并有丝状沉淀产生。在酸性条件下，无此现象。但随酸性增强，茶多糖发生降解，含量下降。2.2绿茶多糖的药理作用绿茶多糖有多种的药理作用，有降血糖、降血脂、抗凝血及抗血栓、增强机体免疫功能、抗癌、防辐射、降血压、减慢心率增加冠脉流量、耐缺氧等作用。在降血糖方面，茶多糖腹腔注射或灌胃均可使正常或糖尿病鼠血糖下降；绿茶多糖可用于糖尿病的辅助治疗，所有患者症状均好转。绿茶多糖的降血糖效果优于消渴丸（主要成分是黄芪生地黄天花粉葛根五味子山药和优降糖）1。目前文献中关于茶多糖降血糖治疗机制涉及较少。在我国和日本民间一直有用粗老茶治疗糖尿病的传统；小鼠在腹腔注射茶多糖后，血清甘油三酯、胆固醇含量比对照组均有降低趋势；在动物免疫功能试验中，注射不同剂量茶多糖的小鼠血清中异物清除率值均有明显增加。茶多糖的降血糖作用已得到公认，大量研究证明，茶多糖对糖尿病有明显的疗效。糖尿病的辅助治疗；蔡鸿恩用粗老茶对糖尿病进行临床运用，均取得了良好的效果。糖尿病患者饭后服用含有茶多糖的饮料，4周后，其血糖含量和糖基化血红蛋白值均有明显的下降。茶多糖的第2个功能是降血脂。高脂血症大鼠口服茶多糖总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇等有明显降低趋势。3.绿茶多糖提取工艺的研究3.1传统工艺现今关于茶多糖的提取方法，报道的主要有酸提法、碱提法、水提法、微波辅助提取法、酶提法和超声波提取法等2。3.1.1酶提法和超声波提取酶工程技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项新型生物工程技术，选用合适的酶，可较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放，从而提高得率。超声波提取主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取，具有高效、适用性广、条件温和等优点。3.1.2水提法茶多糖的水提法提取工艺的研究,国内许多报道，可分为单独提取法和综合提取法。(1)茶多糖单独提取法a.原料水浸提 (23次)沉淀过滤取滤液浓缩乙醇沉淀过滤、回收乙醇粗多糖精制、干燥茶多糖。b.原料乙醇浸泡回流(3次)取滤渣水浸提 (3次)过滤提取液浓缩、脱脂、脱蛋白、脱色等乙醇沉淀(2次)取滤渣精制、干燥茶多糖。和方法a相比，该方法在原料提取前用乙醇浸泡脱去一些酚类色素和溶于醇的小分子杂质，为纯化精制打下了基础。c.原料预处理（乙醇浸泡或者酶水解）水浸提超滤取滤液乙醇沉淀干燥茶多糖。该方法在前两种的方法的基础上将超滤膜引入到茶多糖的提取工艺上，用超滤法对提取液进行粗分离，实现了茶多糖与茶多酚、咖啡碱的分离，提高了多糖的纯度。(2)茶多糖综合提取法该方法的最后产物不但得到茶多糖，还得到咖啡碱和茶多酚，具有简化、效益高等优点。大致也可分下面两类。a.原料沸水浸提(2次)离心、除渣提取液氯仿萃取有机层回收氯仿、精制、干燥 咖啡碱有机层回收、精制、干燥茶多酚水层乙酸乙酯萃取水层乙醇醇析离心、取滤渣、精制、干燥茶多糖b.原料乙醇浸提滤渣酸性乙醇提取滤液丙酮分离回收、精制、干燥茶多糖 有机层回收、精制、干燥咖啡碱滤液浓缩氯仿萃取回收、精制、干燥茶多酚 水层乙酸乙酯萃取水层浓缩、干燥水溶性复合物这两种方法的区别就在于前者是用水提取的，而后者是用醇提取的，并且后者用了丙酮来粗分离。单独提取法与综合提取法的比较：对由以上提取方法所得到的产物进行比较可知，单独提取法仅提取茶多糖，其中的茶多酚和咖啡碱则未被利用；综合提取法分别提取茶叶中的茶多糖、茶多酚、咖啡碱，可以得到3种产品，具有简化、省试剂、效益高等优点。在工业生产中，宜采用综合提取法，有利于降低成本、提高经济效益3-4。3.2缺点分析目前国内对茶多糖的提取分离和纯化的研究不够深入，阻碍了茶多糖生物活性的系统研究和作为功能原料的开发。同时茶多糖是一种糖蛋白在脱蛋白的同时带走大量的糖类含量降低，造成大量的浪费，损失了珍贵的资源。4.绿茶多糖对糖尿病作用效果4.1研究现状糖尿病的主要特征为胰岛素抵抗和胰岛素分泌绝对或相对不足，以及由此导致糖、蛋白质和脂肪代谢紊乱。从天然植物中寻找有效的降血糖成分可能为治疗糖尿病提供新的方法。前人大量实验已经证实绿茶的确具有降低血糖的功效，其主要的药理成分为绿茶多糖。粗老绿茶中含有较丰富的多糖。绿茶多糖灌胃后，正常和高血糖小鼠血糖均表现为显著下降，认为绿茶多糖对糖代谢的影响与胰岛素类似。陈海霞（2002）5研究了低档绿茶中的茶多糖对小鼠实验性糖尿病的防治作用，结果表明，以400mg/Kg茶多糖灌胃，对正常小鼠及实验性糖尿病小数均有降血糖的作用。陈建国等（2003）从老茶树粗老茶叶中提取茶多糖，研究其降血糖和改善糖尿病症状的效果，结果表明，茶多糖能明显换届糖尿病小鼠的“三多一少”症状，明显降低其空腹血糖，控制其饮水量，促进其体重恢复，并存在一定的剂量-反应关系。4.2 研究不足由于糖尿病的发病机理复杂，因此关于绿茶多糖降低血糖的作用机理、应用前景以及纯化和结构分析还没有探究明白，正在进一步研究中，需要设计更加详细的实验来研究绿茶多糖的治疗糖尿病机理。5.总结本设计的研究宗旨及意义糖尿病近年来已成为一种多发病，无论在发达国家还是发展中国家，均已正在成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重慢性非传染性疾病，对人们的身心健康造成极大的危害。型糖尿病起病时症状比较隐蔽，很难在初发时即获确诊，但其患病率较高。一般用患病率对型糖尿病的流行病学特点进行研究。近年来，世界各国2型糖尿病的患病率均有急剧增加的趋势，型糖尿病患者激增是造成全世界糖尿病患者总数剧增的主要原因。目前糖尿病的治疗主要集中在降血糖药物和胰岛素治疗，但是二者都存在严重的毒副作用，且都不能有效预防并发症。最新研究表明，绿茶作为一种世界流行饮料，能够有效预防和治疗糖尿病及其并发症。其药效成分为绿茶多糖，因此绿茶多糖的降血糖机理研究越来越受到关注。而且近年来有关茶多糖及其药理作用的研究报道也逐渐增多，动物试验和临床研究报道茶多糖在降血糖和防治糖尿病方面有效，但有关绿茶多糖降血糖机制的研究报道较少，研究内容也不够详尽深入。本实验以型糖尿病小鼠为实验对象，审计方法探究绿茶多糖降血糖的治疗机制。本文综述了绿茶多糖的精制工艺，通过实验分析就绿茶多糖治疗糖尿病的机理进行深入研究。第二部分 课程设计部分绿茶多糖对型糖尿病小鼠治疗机制研究的设计随着社会的快速发展和生活水平的提高，糖尿病近成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重慢性非传染性疾病，对人们的身心健康造成极大的危害。其中2型糖尿病起病时症状比较隐蔽，很难在初发时即获确诊，但其患病率较高。一般用患病率对2型糖尿病的流行病学特点进行研究。近年来，世界各国2型糖尿病的患病率均有急剧增加的趋势，型糖尿病患者激增是造成全世界糖尿病患者总数剧增的主要原因。因此糖尿病的治疗成为医学界一大攻克难题。目前糖尿病的治疗主要集中在降血糖药物和胰岛素治疗，但是二者都存在严重的毒副作用，且都不能有效预防并发症。绿茶作为一种世界流行饮料，能够有效预防和治疗糖尿病及其并发症。绿茶多糖是从绿茶中提取出来的一种酸性糖蛋白,并结合有大量的矿质元素，其上蛋白部分主要由约20种常见的氨基酸组成，糖的部分主要由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等，矿质元素主要由钙、镁、铁、锰等及少量的微量元素，如稀土元素等组成，其分子量约为107000-114000。糖蛋白经脱蛋白后获得的多糖成分是绿茶的药效成，因此绿茶多糖的降血糖机理研究越来越受到关注。本设计拟定绿茶多糖的提取新工艺并以型糖尿病小鼠为实验对象运用药物灌胃实验探究绿茶多糖对型糖尿病小鼠的治疗机理：绿茶多糖灌胃糖尿病小鼠前后的空腹血糖水平分析，绿茶多糖对糖尿病小鼠糖耐量及体重的影响，绿茶多糖对糖尿病小鼠血糖、胰岛素、血脂、果糖胺及肝糖原的影响等方面深入检测，在获得结果的同时研究机理，为绿茶及其多糖制品在人类糖尿病的预防治疗方面的应用提供科学依据。1试验材料1.1粗老绿茶1.1.1原料粗老绿茶由云南思茅市龙生公司茶厂生产的云南大叶种无性系，购于秦皇岛茶叶零销处。1.12实验试剂DEAE-纤维素DE一52(whatman公司)Sephacryl S一300(Pharmacia公司)单糖标准品(Sigma公司)半乳糖醛酸(Fluka公司)1.13实验仪器bradford法蛋白测定试剂盒(碧云天公司)；Avanti J-30I高速冷冻离心机(BECKMAN COULTER公司)；UV-2550紫外可见分光光度计(SHIMADZU公司)；Nicolet Nexus 670 FT-IR傅立叶变换红外光谱分析仪；FTS SYSTEMS冷冻干燥机；Agilent 1100系列高效液相色谱仪(HPLC) (ALLTECH公司)；蒸发光散射检测器(ALLTECH ELSD 2000ES (ALLTECH公司)；TSK-GEL G4000PWxL凝胶色谱柱(TOSOH公司)；气质联用仪(GCMS)(6890N-MSD：5973i，Agilent)；色谱柱：J&W DB-5MS(30 m025 mm i.d，0.25 mdf)。其它试剂为国产分析纯。1.2实验小鼠1.21原材料KKAY糖尿病小鼠48只，雌雄各半，体重2025 g，购自中国医学科学院实验动物中心。1.22饲养条件实验小鼠饲以基础饲料(由动物中心提供)，用不锈钢鼠笼喂养，自由饮水，动物房温度控制在2025、湿度5565、光照1012 hd，鼠笼隔天清洗消毒1次。1.23实验仪器葡萄糖测定试剂盒（宁波市慈城生化试剂厂）；超氧化物歧化酶（SOD）（南京建成生物工程研究所）；GSH-PX测试盒/谷胱甘肽过氧化物酶测试盒(LC0024 上海江莱生物科技有限公司)；ATP，MADP和G6PD(上海巴贝赛克生物工程技术服务有限公司)；三羟甲基氨基甲烷（Tris，Ultra Pure Grdde，USA分装）(北京生工生工程有限公司)；四氧嘧啶(ALLOXAN)(SIGMA公司产品)；试剂均为分析纯。2.方法2.1绿茶多糖提纯新工艺及成分检测2.11新工艺1.茶叶粗多糖提取参见文献6，水提，乙醇沉淀，H202脱色，三氯乙酸去蛋白，透析，冻干，得粗多糖。2.茶叶多糖纯化绿茶粗多糖过DEAE-纤维素DE52离子交换柱层析（柱规格：2.6cm50cm,填料高42cm,2.13ml/min,4ml/管），洗脱液依次为：H2O、0.10mol/L NaCl、0.250mol/L NaCl和0.4,0mol/L NaCl，分步收集，蒽酮-硫酸法示踪检测，根据洗脱曲线的主峰位合并收集液，透析，真空冷冻干燥得若干。茶多糖纯化组分；各纯化组分分别经Sephacryl S-300应缴柱层析（柱规格：1.6cm50cm,填料高40cm,0.3ml/min,9ml/管），洗脱液0.035mol/L NaCl,同前述方法检测，根据洗脱曲线合并收集液，透析，真空冷冻干燥得二级纯化的绿茶多糖组分。2.12成分鉴定1.二级纯化组分糖含量和蛋白质含量测定蒽酮硫酸法测定茶多糖中性糖含量14l，硫酸咔唑法测定多糖糖醛酸含量，bradford法测定蛋白质含量。123二级纯化分级组分的单糖组成及比例61称取5 mg各二级纯化茶多糖组分样品及单糖标准品，加5ml 3molL的H2S04封管，110反应6h，BaC03粉末中和，过滤，干燥，得到水解后的单糖混合物。取各样品水解后的单糖混合物，分别加入10 mg盐酸羟胺和O4m1吡啶，95水浴40min，冷却至室温后，加人0.6 ml乙酸酐，95恒温水浴40 min，冷却至室温，得糖腈乙酸酯衍生物，直接进样。80，1 min；250，3 min，进样器温度260。载气：氦气，1 mlmin。2.二级纯化分级组分的HPGPCELSD分析将茶多糖各二级纯化组分样品配制成2mgmi浓度的水溶液。HPGPC分析条件：进样量20ul；柱温40；流动相：H20，流速：0.5 mlmin；雾化气体(氮气)流速3.2Lrain，漂移管温度115。3.二级纯化分级组分紫外可见和红外光谱分析将茶多糖二级纯化分级组分样品配制成80 ugml浓度溶液，在700200 nm区域扫描；茶多糖纯化分级组分经KBr压片，400nm红外波数范围内扫描。2.2糖尿病小鼠培养灌胃技术小鼠经口灌胃给药方法7：先保定动物，即用右手将小鼠尾巴提起，置于鼠笼或粗糙的平面上，当小鼠向前挣扎时，用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳后颈背皮肤，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指压住小鼠尾巴即可。在保定小鼠过程中，不要用力过大，勿握其颈部，以免窒息死亡。以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针进入约3cm左右时即达胃内。如果灌胃针的位置插入正确，小鼠可自行吞服药，灌胃针插入位置不正确，小鼠会强烈挣扎，必须拔出重插，否则可能将药物灌入气管，造成小鼠死亡。注完药液后轻轻抽出灌胃针。根据前人实验结果可知灌胃液体容积量为0.01倍小鼠体重(g)角标400 mgKg体重茶多糖8 。2.3.型糖尿病小鼠灌胃前后的空腹血糖水平测定将实验用KKAY糖尿病小鼠,按要求进行灌胃实验，每周测定小鼠空腹血糖1次，测定前禁食12h，断尾取血，测定血糖。小鼠再禁食12小时后，腹腔注射四氧嘧啶(200mg/Kg体重)；造模后实验组和对照组均不再进行灌胃；造模后3天测定小鼠空腹血糖。血糖一GOD-PAP法9测定：原理：葡萄糖和02、H20反应生成葡萄糖酸和过氧化氢(H202)，反应生成的H202和4-AAP、酚进一步反应生成红色醌亚胺。通过测定生成物红色醌亚胺的浓度计算葡萄糖的浓度。操作步骤：按试剂盒测定步骤进行，具体操作如下：测定管 标准管 空白管血清 （l） 20 标准（l） 20 工作试剂（l） 2.0 2.0 2.0混匀，置37水浴10分钟500nm波长空白管调零，读取测定管和标准管的A值。按下式计算葡萄糖浓度：测定管A 标准管浓度 = 葡萄糖（mmol/L）标准管A2.4糖尿病小鼠糖代谢有关酶活力的测定将实验用KKAY糖尿病小鼠分组后，分别用适宜浓度绿茶多糖和生理盐水进行灌胃，8周后，实验动物处死后取肝脏，测定肝脏SOD和GSHPx活性，MDA含量。2.4.1超氧化物歧化酶(SOD) 9原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫色，用可见分光光度计测其吸光度。当被测样品中含超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)时，则对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度，通过公式计算可求出被测样品的SOD活力。操作步骤一总SOD(T-SOD)活力的测定：按试剂盒测定步骤进行，具体操作如下：试剂 测定管 标准管1号试剂（ml） 1.0 1.01%肝匀浆（l） 50 蒸馏水（ml） 0.5 0.52号试剂（ml） 0.1 0.13号试剂（ml） 0.1 0.1 4号试剂（ml） 0.1 0.1 用旋涡混匀器充分混匀，置37恒温水浴40分钟。显色剂分别加入20m1混匀，10分钟后倒入lcm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550nm处比色。组织中SOD活力计算：定义：每毫克组织蛋白在lml反应液中SOD抑制率达50时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU)。计算公式如下： 对照管吸光度测定管吸光度组织匀浆中SOD活力 = 50% （NU/mg protein） 对照管吸光度 反应液总体积（ml） 组织中蛋白量(mg proteinml) 取样量（ml）2.4.2谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 9谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH（谷胱甘肽）产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关，可以直接用谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒进行测定。2.4.3葡萄糖激酶葡萄糖激酶是调节人体血液中葡萄糖水平的重要酶，主要作用是监控血中的葡萄糖水平，但在特定条件下，由于葡萄糖激酶过度激活或者失活，导致血液中葡萄糖水平过低或过高，继而引发型糖尿病和高血糖症病变。因此测定其活性可以糖尿病小鼠的糖代谢状况。葡萄糖激酶的活性测定10-12：反应体积3ml，最终含：TrisHCl 100molL，pH7.5；NADP 0.2mmolL；ATP 5mmolL；MgCl2 5mmolL;6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2 molL;每次测定设高糖测定管(葡萄糖终浓度为100mmolL)和低糖测定管(葡萄糖终浓度为O.5mmolL)。上述溶液混匀后置30预温5min，再加肝匀浆上清液20ul反应。用蒸馏调零，在波长340nm处测出每分钟光密度的增加值，并从高糖管斓得值中减去低糖管测得值。酶比活性计算：计算公式为：Amin I6.22 V总V样10001000，其中A是每分钟吸光度的变化，6.22是NADPH在340nm的毫摩尔吸光系数V总表示反应总体积，V样表示吸取上清液的量，两个1000分别是毫摩尔转化为微摩尔和单位IU转化为mlU的转化系数，酶比活性单位为mlUming肝组织。2.5绿茶多糖灌胃后糖尿病小鼠胰腺细胞形态学分析对灌胃后的实验组和对照组的糖尿病小鼠进行处死，取出胰腺，胰腺苏木素一伊红(HE)染色13制成组织学切片然后在显微镜下进行形态学观察，看胰岛细胞的形状和数量。3.设计3.1绿茶多糖的提取工艺设计首先将准备好的原材料粗老绿茶按照工艺：粗提取茶多糖的离交换柱层析和凝胶柱层析纯化纯化组分糖含量测定糖组分体外活性分析。3.2绿茶多糖灌胃前后小鼠空腹血糖水平变化将试验用KKAY动物随机分为实验组A、B、C3组和对照组a、b、c3组，每组8只。实验组分别以最适浓度的绿茶多糖、对照组以等体积生理盐水连续灌胃。对A和a组，每周测定小鼠空腹血糖1次，测定前禁食12h，断尾取血，测定血糖。小鼠再禁食12小时后，腹腔注射四氧嘧啶(200mg/Kg体重)；造模后实验组和对照组均不再进行灌胃；造模后3天测定小鼠空腹血糖。3.3绿茶多糖对糖尿病小鼠糖代谢变动影响对于B和b组，B组以最适浓度的绿茶多糖、b组以等体积生理盐水连续灌胃8周。8周末时处死动物后，取出肝脏,.测定肝脏SOD和GSHPx活性以及葡萄糖激酶活性。（处死小鼠后，用预冷的剪刀取出肝脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干准确称取肝脏1克，置玻璃瓶70C保存。测定时取出。70保存的肝脏，室温；解冻：肝脏1克，剪碎：加3ml冰预冷匀浆液，置5ml玻璃匀浆器内匀浆；肝组织匀浆液置于低温超速离心机内，4，12000rpm离心10min，取上清液测葡萄糖激酶活性。3.4绿茶多糖对糖尿病小鼠胰腺细胞影响对于C和c组，C组以最适浓度的绿茶多糖、c组以等体积生理盐水连续灌胃8周。8周末处死动物取胰腺，胰腺苏木素一伊红(HE)染色制成组织学切片进行形态学观察，进一步分析该两组胰岛素产生量。4.分析与总结社会的快速发展促使人们生活水平的不断提高，糖尿病作为一种由此导致的“富贵病”已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重慢性非传染性疾病。其中型糖尿病患者的激增是造成全世界糖尿病患者总数剧增的主要原因。对于型糖尿病德预防和治疗，已经成为当今社会的最热点为题之一。茶作为人们生活的必需品之一，有着悠久的历史和博大精深的文化。近年来国内外对茶叶的深入研究也表明，茶叶富含多种矿物质、氨基酸等营养成分以及茶多酚、茶色素等具有多种保健作用的功能因子，特别是对茶叶降糖作用的研究成果为糖尿病患者提供了一种简便易行、便于长期坚持且十分经济的控制病程发展的方法。因此，以茶叶为主要成分或载体的降糖产品的开发也有着非常广阔的前景。其中以茶多糖的降糖作用最为突出。绿茶作为一种世界流行饮料，已经深入人们的生活，故绿茶多糖对糖尿病的预防和治疗更具有研究价值。以往的研究表明，茶叶中除含有茶多酚、生物碱、挥发油等成分外，近年来还发现有另一种组分为茶多糖（TPS）。它们常与蛋白质结合在一起。茶叶中具有降血糖效果的成分是TPS，国内外对TPS的组分及降糖作用也有报道14。同时茶多糖可使.糖尿病小鼠灌胃前后的空腹血糖水平发生变动、影响糖尿病小鼠糖耐量和体重以及对糖尿病小鼠血糖、胰岛素、血脂、果糖胺及肝糖原的多少都会有影响。但是茶多糖到底是怎样在机体内作用，怎样达到降低血糖的目的，到目前为止还没有文章把这复杂的机制研究明白。并且关于绿茶多糖预防和治疗糖尿病的研究更是微乎其微。因此我在借鉴前人实验的基础上，更加具体详尽了实验步骤，运用了更加精确的实验仪器，进行全面的深入的分析，下面我分点介绍本设计的特点。4.1绿茶多糖的提取工艺设计倪德江等15研究多种茶多糖的传统提取方法，可是得到的成分不够纯，茶多糖中会混有未脱掉的蛋白和其他成分，同时得到的茶多糖活性会受到影响。本设计采用层析的方法将粗提取的绿茶多糖进行纯化，期望得到的绿茶多糖含量高并且具有较高的活性，使在作用于试验用糖尿病小鼠是有较好的降血糖作用，有利于实验数据的测量和机理的探究分析。4.2 绿茶多糖灌胃前后小鼠空腹血糖水平变化本设计用最适浓度灌胃，有对照组和实验组各8只小鼠，用GOD-PAP法测定小鼠的血糖，此实验借鉴前人的方法，在仪器上和试剂使用上有有所优化。4.3绿茶多糖对糖尿病小鼠糖代谢变动影响王黎明等16研究时采用测定糖类物质在代谢途径中量的改变，得出茶多糖影响糖代谢的结论。而本设计检测糖尿病小鼠经绿茶多糖灌胃后代谢途径中各种酶的活性，目的是为了了解绿茶多糖是否是通过影响这些代谢相关酶的活性进而影响机体糖代谢。4.4 绿茶多糖对糖尿病小鼠胰岛素产量影响以往的研究实验是通过直接测定代谢情况和胰岛素产生水平。本设计究其根本，通过观察绿茶多糖灌胃后小鼠胰腺细胞的形态和数量的改变，进而推断胰岛素的产生水平。5.心得通过为期三周的课设，我有很多的收获。这不仅仅局限在自己完成了这项任务，而是在这个艰难的过程中一步步走到最后的所见所感所悟。对于我，科研性质的专业论文可以说是可望而不可及的东西，虽然我的专业需要学生广泛阅读相关期刊文献，但我由于自己的惰性和自以为无用的思想，一直未曾碰触。所以在这次课设之初，关于课题选择和有关文献的查阅让我有点应付不来。老师的指点也让我少走了很多弯路：先查资料确定大体知识范围整理