微生物检验规范操作实验室安全基础知识

食品微生物检验规范操作基础培训6实验室安全基础知识 第一部分实验室生物安全基本概念 实验室安全危害来源 生物实验室危害来源 生物危害其他危害 危险性化学品 火的危害 电的危害 噪声 电离辐射等 一 生物安全基本知识 相关文件和标准 中华人民共和国国务院令第424号 病原微生物实验室生物安全管理条例 已经2004年11月5日国务院第69次常务会议通过并施行 共七章七十二条 国家环境保护总局令第32号 病原微生物实验室生物安全环境管理办法 2006年5月1日实施 福建省实验动物许可证管理办法 共15条 2003年十月一日实施 CNAS已于2009年06月30日发布 实验室生物安全认可准则 CNAS CL05 2009 2009年07月01日正式实施 实验室生物安全认可规则 CNAS RL05 2008 世界卫生组织 WHO 实验室生物安全手册 一 生物安全基本知识 相关文件和标准 GB19489 2008实验室生物安全通用要求GB50346 2004生物安全实验室建筑技术规范GB15981 1995消毒与灭菌效果评价方法与标准GB T19495 2 2004转基因产品检测实验室技术要求GB T27403 2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB T27405 2008实验室质量控制规范食品微生物检测GB50073 2001洁净厂房设计规范GBJ19 87采暖通风和空气调节设计规范WS233 2002微生物和生物医学实验室安全通用准则SN T1193 2003基因检验实验室技术要求YY0569 2005生物安全柜ISO14644 1 8洁净室及相关受控环境国际标准ISO DIS14698 1 3 洁净室及相关受控环境生物污染控制 一 生物安全基本知识 什么叫实验室生物安全 Laboratorybilsafety实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平 可避免实验室人员 来访人员 社区及环境受到不可接受的损害 符合相关法规 标准等对实验室生物安全责任的要求 实验室生物安全 一词用来描述那些用以防止发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的防护原则 技术以及实践 实验室生物安全防护 biosafetyprotectionforlaboratories 是指当实验室工作人员所处理的实验对象含有致病性微生物及其毒素时 通过在实验室设计建造 使用个体防护设施 严格遵守标准化工作及操作程序等方面采取综合措施 以确保实验室工作人员不受实验室对象侵染 确保周围环境不受污染 一 生物安全基本知识 实验室生物安全保障 laboratorybiosecurity 实验室生物安全保障 则是指单位和个人为防止病原体或毒素丢失 被窃 滥用 转移或有意释放而采取的安全措施 气溶胶aerosols悬浮于气体介质中的粒径一般为0 001 100 m的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系 一 生物安全基本知识 感染性微生物的危险度等级分类 危险度1级 无或极低的个体和群体危险 不太可能引起人或动物致病的微生物 危险度2级 个体危险中等 群体危险低 病原体能够对人或动物致病 但对实验室工作人员 社区 牲畜或环境不易导致严重危害 实验室暴露也许会引起严重感染 但对感染有有效的预防和治疗措施 并且疾病传播的危险有限 危险度3级 个体危险高 群体危险低 病原体通常能引起人或动物的严重疾病 但一般不会发生感染个体向其他个体的传播 并且对感染有有效的预防和治疗措施 危险度4级 个体和群体的危险均高 病原体通常能引起人或动物的严重疾病 并且很容易发生个体之间的直接或间接传播 对感染一般没有有效的预防和治疗措施 一 生物安全基本知识 实验室分级 实验室可以分为 基础实验室 生物安全防护水平一级 BSL 1 基础实验室 生物安全防护水平二级 BSL 2 防护实验室 生物安全防护水平三级 BSL 3 最高防护实验室 生物安全防护水平四级 BSL 4 根据操作不同危险度等级微生物所需的实验室设计特点 建筑构造 防护设施 仪器 操作以及操作程序来决定实验室的生物安全水平 表1叙述了与不同危险度等级相对应的 而非 等同的 各危险度等级微生物所要求的实验室生物安全水平 生物安全水平 操作和设备 BSC 生物安全柜 GMT 微生物操作技术规范 不同生物安全水平对设施的要求 a在环境与功能上与普通流动环境隔离b取决于排风位置 不同生物安全水平对设施的要求 c取决于实验室中所使用的微生物因子d例如 观察窗 闭路电视 双向通讯设备 个体防护装备 食品中微生物危害主要分为以下几类 细菌性危害 包括引起食物中毒的细菌及其毒素造成的危害 真菌性危害 包括真菌及其毒素造成的危害 病毒性危害 包括甲型肝炎病毒 诺如病毒等肠道病毒引起的危害 寄生虫性危害 包括蠕虫和原虫等引起的危害 二 食品检测领域 生物危害 二 食品检测领域 生物危害分级 我国从事食品微生物检测的实验室开展的检测项目包括 细菌总数 大肠菌群 粪大肠菌群等卫生指标菌的检测 所有食品微生物检测实验室均从事这些项目的检测 根据世界卫生组织 WHO 美国疾病预防控制中心 CDC 加拿大卫生部 我国卫生部等组织制定生物安全防护水平分类标准 从事此类微生物检测的实验室的安全防护等级为生物安全一级 BSL 二 食品检测领域 生物危害分级 人间传染病原微生物名录 动物病原微生物名录 从事此类微生物检测的实验室的安全防护等级为生物安全二级 BSL 沙门氏菌志贺氏菌金黄色葡萄球菌蜡样芽胞杆菌大肠杆菌O157副溶血性弧菌 霍乱弧菌 创伤弧菌 溶藻弧菌单核增生李斯特氏菌空肠弯曲杆菌小肠结肠炎耶尔森氏菌气单胞菌假单胞菌霉菌和酵母菌计数 产毒真菌 黄曲霉 桔青霉 展青霉 禾谷镰刀菌 茄病镰刀菌 头孢霉等 诺如病毒 轮状病毒等肠道病毒 海产品 蔬菜 水果 甲型肝炎病毒 海产品 蔬菜 水果 二 食品检测领域 生物危害 食品微生物检测涉及的样品种类 1定型包装食品2即食食品3速冻食品4新鲜蔬菜 水果5冷冻与新鲜肉类6冷冻与新鲜水产品其中1 3类样品被致病性微生物污染的机率和程度相对较低 4 6类样品被致病性微生物污染的机率和程度较高 生物安全风险较高 第二部分基础实验室 一级和二级生物安全水平 安全指南 主要内容 实验室的设计和设施实验室的基本规范健康和医学监测培训实验室设备检测过程安全防护废弃物处理 一 实验室的设计和设施 在设计实验室和安排某些类型的实验工作时 对于那些可能造成安全问题的情况要加以特别关注 这些情况包括 1 气溶胶的形成2 处理大容量和 或高浓度微生物3 仪器设备过度拥挤和过多4 啮齿动物和节肢动物的侵扰5 未经允许人员进入实验室6 工作流程 一些特殊标本和试剂的使用 设施和设备要求详见GB T19489 2008中的要求 典型的一级生物安全水平实验室 典型的二级生物安全水平实验室 在生物安全柜中进行可能发生气溶胶的操作程序 门保持关闭并贴上适当的危险标志 潜在被污染的废弃物同普通废弃物隔开 二 实验室的基本规范 BSL 和BSL 实验室 1 进入规定2 工作人员的防护要求3 有关安全操作4 实验室工作区5 生物安全管理 1 进入规定 1 在处理危险度2级或更高危险度级别的微生物时 在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志 图1 2 只有经批准的人员方可进入实验室工作区域 3 实验室的门应保持关闭 4 儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域 5 进入动物房应当经过特别批准 6 与实验室工作无关的动物不得带入实验室 2 人员防护 1 在实验室工作时 任何时候都必须穿着连体衣 隔离服或工作服 2 在进行可能直接或意外接触到血液 体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时 应戴上合适的手套 手套用完后 应先消毒再摘除 随后必须洗手 3 在处理完感染性实验材料和动物后 以及在离开实验室工作区域前 都必须洗手 4 为了防止眼睛或面部受到泼溅物 碰撞物或人工紫外线辐射的伤害 必须戴安全眼镜 面罩 面具 或其他防护设备 5 严禁穿着实验室防护服离开实验室 如去餐厅 咖啡厅 办公室 图书馆 员工休息室和卫生间 6 不得在实验室内穿露脚趾的鞋子 7 禁止在实验室工作区域进食 饮水 吸烟 化妆和处理隐形眼镜 8 禁止在实验室工作区域储存食品和饮料 9 在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内 3 有关安全操作 1 严禁用口吸移液管 2 严禁将实验材料置于口内 严禁舔标签 3 所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行 4 应限制使用皮下注射针头和注射器 除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液 皮下注射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途 5 出现溢出 事故以及明显或可能暴露于感染性物质时 必须向实验室主管报告 实验室应保存这些事件或事故的书面报告 6 必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序 并予以遵守执行 7 污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染 采用化学或物理学方法 根据所处理的微生物因子的危险度评估结果 可能需要准备污水处理系统 8 需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染 4 实验室工作区 1 实验室应保持清洁整齐 严禁摆放和实验无关的物品 2 发生具有潜在危害性的材料溢出以及在每天工作结束之后 都必须清除工作台面的污染 3 所有受到污染的材料 标本和培养物在废弃或清洁再利用之前 必须清除污染 4 在进行包装和运输时必须遵循国家和 或国际的相关规定 5 如果窗户可以打开 则应安装防止节肢动物进入的纱窗 5 生物安全管理 1 实验室主任 对实验室直接负责的人员 负责制订和采用生物安全管理计划以及安全或操作手册 2 实验室主管 向实验室主任汇报 应当保证提供常规的实验室安全培训 3 要将生物安全实验室的特殊危害告知实验室人员 同时要求他们阅读生物安全或操作手册 并遵循标准的操作和规程 实验室主管应当确保所有实验室人员都了解这些要求 实验室内应备有可供取阅的安全或操作手册 4 应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案 5 如有必要 应为所有实验室人员提供适宜的医学评估 监测和治疗 并应妥善保存相应的医学记录 三 健康和医学监测 主管机构有责任通过实验室主任来确保实验室全体工作人员接受适当的健康监测 监测的目的是监控职业获得性疾病 为达到这些目的 应进行如下工作 1 根据需要提供主动或被动免疫 工作人员的免疫接种 2 促进实验室感染的早期检测3 应禁止高度易感人群 如孕妇或免疫损伤人员 在高危险实验室中工作4 提供有效的个体防护装备和方法 在一级生物安全水平操作微生物的实验室工作人员的监测指南 历史证据表明 在一级生物安全水平操作的微生物不太可能引起人类疾病或兽医学意义的动物疾病 但理想的做法是 所有实验室工作人员应进行上岗前的体检 并记录其病史 疾病和实验室意外事故应迅速报告 所有工作人员都应意识到应用规范的实验室操作技术的重要性 在二级生物安全水平操作微生物的实验室工作人员的监测指南 1 必须有录用前或上岗前的体检 记录个人病史 并进行一次有目的的职业健康评估 2 实验室管理人员要保存工作人员的疾病和缺勤记录 3 育龄期妇女应知道某些微生物 如风疹病毒 的职业暴露对未出生孩子的危害 保护胎儿的正确措施因妇女可能接触的微生物而异 四 培训 进入实验室工作人员必须经过培训 方能取得进入实验室控制区域工作的资格 培训由实验室负责人组织 熟悉实验室工作和操作规范的人员担任辅导 培训内容包括 1 实验室生物安全管理规定 自身防护的规定及相关的其它规定 2 实验室各项仪器装备的使用方法 3 正确的着装方法 4 微生物学操作基本技术及无菌操作方法 5 实验室清洁及消毒方法 6 意外事故处理方法 7 国内外新技术 新方法等的不定期培训 培训的实施细则 1 理论培训 l 培训目标 熟悉本实验室的各项规章制度和操作规范 形成初步的实验室工作概念 了解本实验室从事工作的特点以及各种微生物的危害评估文件 2 培训方式 讲解 3 培训内容 本实验室各项成文的规章制度 生物安全防护 废弃物处理 安全制度 卫生制度 责任制度 试剂定购制度 仪器使用制度等 实验室的各项规章制度和生物安全管理手册 4 考核 由本实验室三位工作人员组织对理论学习的书面考试和面试工作 书面考试注重其掌握的准确程度 面试主要测试其熟练程度和灵活应变能力 考核本合格者须重新学习 不能进入下一步的培训 培训的实施细则 2 常规技能培训 l 培训目标 熟练基本实验操作和仪器的使用 初步培养实验的基本观念和良好的实验习惯 2 培训方式 现场实验 3 培训内容 卫生打扫 实验室地面 实验台面 超净台面 垃圾处理以及打扫得先后顺序 工作休息区的卫生打扫 实验室常规操作技术 包括无菌观念 平板的制备 划线分离 显微镜观察 菌落接种 活化 菌体收集 菌 毒 种保存等 小型仪器的使用 微量移液器和移液管的使用 pH计和试纸 天平 混匀器 微波炉 电磁炉 水浴锅等 玻璃仪器的清洗 量筒 烧杯 三角瓶等 大型仪器的使用 普通冰箱和低温冰箱 存放和处理样品 高压锅 离心机 液氮罐 生物安全柜 生化培养箱 电泳设备 超净台 PCR仪 摇床 超声破碎仪 显微镜等 消毒和灭菌方法 物理灭菌 紫外 过滤 灼烧 高压 法 化学灭菌 熏蒸 酒精 消毒液 法等 办公用品使用的培训 电话 传真机 电脑 打印机等 五 实验室设备 选择设备时应符合一些基本原则 即 1 在设计上应能阻止或限制操作人员与感染性物质间的接触2 建筑材料应防水 耐腐蚀并符合结构要求3 设备装配后应无毛刺 锐角以及易松动的部件4 设备的设计 建造与安装应便于操作 易于维护 清洁 清除污染和进行质量检验 应尽量避免使用玻璃及其他易碎的物品 需要详细咨询设备的性能和结构规格 以确保设施具备必要的安全特性 基本生物安全设备 1 移液辅助器 避免用口吸的方式移液 有不同设计的多种产品可供使用 2 生物安全柜 在以下情况使用 处理感染性物质 如果使用密封的安全离心杯 并在生物安全柜内装样 取样 则这类材料可在开放实验室离心 空气传播感染的危险增大时 进行极有可能产生气溶胶的操作时 包括离心 研磨 混匀 剧烈摇动 超声破碎 打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器 动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织 3 一次性塑料接种环 也可在生物安全柜内使用电加热接种环 以减少生成气溶胶 4 螺口盖试管及瓶子 5 用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具 6 一次性巴斯德塑料移液管 尽量避免使用玻璃制品 7 在投入使用前 像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收 应参照生产商的说明书定期检测 常用设备的安全操作注意事项 1 生物安全柜分为I II III个不同等级 I级能够保护工作人员和周围环境 但不能切实保护操作样本 因此生物安全柜I级不能用于食品微生物检验的无菌操作 II级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护 而且能保护工作台面的物品不受空气的污染 其有四种不同的类型 A1 A2 B1和B2型 可用于操作危险度II级和III级的感染性物质 III级生物安全柜则可提供更高级别的生物安全保护 常用设备的安全操作注意事项 2 生物安全柜使用要点 1 使用者应熟知生物安全柜的使用方法和局限性 2 使用前后 工作台面和内壁要用消毒剂擦拭消毒 生物安全柜风机应至少运行5min完成净化后使用 3 使用中不能打开玻璃观察档板 应穿个体防护服 4 生物安全柜内尽量少放置器材或标本 不能影响后部压力排风系统的气流循环 5 放入生物安全柜的物品应采用70 酒精来清除表面污染 可以在消毒剂浸湿的毛巾上进行实验 以吸收可能溅出的液滴 6 耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及移液适宜于盛放盘不应放在生物安全柜的外面 7 在工作台面上的操作应按照从清洁区到污染区的方向进行 8 在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中 应避免使用明火 可使用电热式接种环灭菌器 最好使用一次性无菌接种环 9 尽可能避免双臂频繁进出生物安全柜 否则会干扰空气屏障的完全性 影响防护 10 一旦发生生物学危害物品溢出 应在生物安全柜运行状态下清理 使用有效的消毒剂 尽可能减少气溶胶 所有接触溢出的物品都要进行消毒或高压灭菌 11 每年应对生物安全防护效果进行测试 定期维护 常用设备的安全操作注意事项 3 离心机离心机是最常用的实验室仪器 最易导致实验室污染 掌握正确的离心机使用技术十分重要 1 在使用实验室离心机时 仪器良好的机械性能是保障微生物安全的前提条件 2 应按照操作手册来操作离心机 3 离心机放置的高度应当使小个子工作人员也能够看到离心机内部 以正确放置十字轴和离心桶 4 离心管和盛放离心标本的容器应当由厚壁玻璃制成 或最好为塑料制品 并且在使用前应检查是否破损 5 用于离心的试管和标本容器应当始终牢固盖紧 最好使用螺旋盖 6 离心桶的装载 平衡 密封和打开必须在生物安全柜内进行 7 离心桶和十字轴应按重量配对 并在装载离心管后正确平衡 8 操作指南中应给出液面距离心管管口需要留出的空间大小 9 空离心桶应当用蒸馏水或乙醇 异丙醇 7O 来平衡 1O 对于危险度3级和4级的微生物 必须使用可封口的离心桶 安全杯 11 当使用固定角离心转子时 必须小心不能将离心管装得过满 否则会导致漏液 12 应当检查离心机内转子部位的腔壁是否被污染或弄脏 如污染明显 应重新评估离心操作规范 13 应当检查离心转子和离心桶是否有腐蚀或细微裂痕 14 每次使用后 要清除离心桶 转子和离心机腔的污染 15 使用后应当将离心桶倒置存放使平衡液流干 16 良好的离心操作技术和牢固加盖的离心管可以提供足够的保护 以防止感染性气溶胶和可扩散粒子的产生 常用设备的安全操作注意事项 4 移液管 移液器 1 应使用移液设备 严禁用口吸取 2 所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染 3 不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体 4 感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合 5 不能将液体从移液管内用力吹出 6 刻度对应 mark to mark 移液管不需要排出最后一滴液体 因此最好使用这种移液管 7 污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中 移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理 8 盛放废弃移液管的容器不能放在外面 应当放在生物安全柜内 9 有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液 1O 在打开隔膜封口的瓶子时 应使用可以使用移液管的工具 而避免使用皮下注射针头和注射器 11 为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散 在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸 使用后将其按感染性废弃物处理 常用设备的安全操作注意事项 5 接种环使用封闭式微型电加热器消毒接种环 能够避免在酒精灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅 最好使用不需要进行消毒的一次性接种环 常用设备的安全操作注意事项 6 冰箱与冰柜 1 冰箱 低温冰箱和干冰柜应当定期除霜和清洁 应清理出所有在储存过程中破碎的安瓿和试管等物品 清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护 清理后要对内表面进行消毒 冰箱内物品放置应规范 2 储存在冰箱内的所有容器应当清楚地标明内装物品的科学名称 储存日期和储存者的姓名 未标明的或废旧物品应当高压灭菌并丢弃 3 应当保存一份冻存物品的清单 4 除非有防爆措施 否则冰箱内不能放置易燃溶液 冰箱门上应注明这一点 常用设备的安全操作注意事项 7 高压灭菌器和灭菌消毒设备 1 应由受过良好培训的人员负责高压灭菌器的操作和日常维护 2 预防性的维护程序应包括 由有资格人员定期检查灭菌器柜腔 门的密封性以及所有的仪表和控制器 3 应使用饱和蒸气 并且其中不含腐蚀性抑制剂或其他化学品 这些物质可能污染正在灭菌的物品 4 所有要高压灭菌的物品都应放在空气能够排出并具有良好热渗透性的容器中 灭菌器柜腔装载要松散 以便蒸汽可以均匀作用于装载物 5 当灭菌器内部加压时 互锁安全装置可以防止门被打开 而没有互锁装置的高压灭菌器 应当关闭主蒸汽阀并待温度下降到80 以下时再打开门 6 当高压灭菌液体时 由于取出时液体可能因过热而沸腾 故应采用慢排式设置 7 即使温度下降到80 以下 操作者打开门时也应当戴适当的手套和面罩来进行防护 8 在进行高压灭菌效果的常规监测中 生物指示剂或热电偶计应置于每件高压灭菌物品的中心 最好在 最大 装载时用热偶计和记录仪进行定时监测 以确定灭菌程序是否恰当 9 灭菌器的排水过滤器 如果有 应当每天拆下清洗 1O 应当注意保证高压灭菌器的安全阀没有被高压灭菌物品中的纸等堵塞 常用设备的安全操作注意事项 8 均质器 研磨器 超声处理器在使用均质器 研磨器 超声处理器时 含有感染性物质的气溶胶可能溢出 应戴手套并于吸收性材料罩住 在生物安全柜中操作 六 检测过程 识别实验过程中的生物危害 食品微生物检测实验操作中可能存生物危害的材料与操作 1 样本采集与运输2 样品接收与处理新鲜蔬菜 水果 冷冻与新鲜肉类 冷冻与新鲜水产品 在样品称量和匀浆过程中 有直接接触感染的可能性 3 样品检验 1 样品的增菌培养样品通过增菌后微生物大量繁殖 在转接过程中有产生气溶胶和意外溅洒的可能 实验者有直接大剂量接触致病菌的机会 2 可疑菌株分离分离培养的过程中 有产生气溶胶和意外溅洒的可能 实验者有直接大剂量接触致病菌的机会 3 生化及血清学鉴定实验过程中要进行培养物的划线 穿刺转接 纯培养物的混匀 生化培养管及诊断血清的开启等操作 实验中有产生气溶胶 意外溅洒的可能 有被利器割伤的可能 并且 在实验过程中直接接触致病菌的纯培养物 4 质控实验使用的阳性菌株培养物质控实验中如果使用标准菌株 在菌株的活化 培养 转接过程中有被利器割伤 产生气溶胶和意外溅洒的可能 实验者有直接大剂量接触致病菌的机会 5 其他操作 如PCR鉴定在使用PCR进行鉴定时 要对培养后的菌液进行离心处理 容易形成气溶胶 实验者有被致病菌感染的可能 六 检测过程 识别实验过程中的生物危害 六 检测过程 安全操作注意事项 1 1 样品称量和匀浆 1 实验室不能使用家用 厨房 匀浆器 因为它们可能泄漏或释放气溶胶 使用实验室专用匀浆器更为安全 2 盖子 杯子或瓶子应当保持正常状态 没有裂缝或变形 盖子应能封盖严密 衬垫也应处于正常状态 3 在使用匀浆器 摇床和超声处理器时 容器内会产生压力 含有感染性物质的气溶胶就可能从盖子和容器间隙逸出 应戴上手套并用吸收性材料包住 4 由于玻璃可能破碎而释放感染性物质并伤害操作者 建议使用塑料容器 尤其是聚四氟乙烯 polytetrafluoroethylene PTFE 容器 5 样品匀浆后应静置2分钟 待气溶胶沉降后 在生物安全柜内打开容器 6 样品称量结束后 应使用与开始工作前相同的消毒方法对实验区域进行消毒 与样品接触的器具 容器 手套和其他材料在清洗和弃置前必须进行消毒 六 检测过程 安全操作注意事项 2 2 增菌培养 生化及血清鉴定转接是增菌培养过程常用的操作 要使用无菌技术以避免菌株的污染 增菌培养使用的容器 应选用密闭 不易破碎的塑料容器 使用玻璃容器时 应轻拿 轻放 涉及致病菌的增菌 生化转接 血清学实验操作应在生物安全柜中进行 注意 各种规范的实验操作技术 六 检测过程 安全操作注意事项 3 分子生物学检测使用增菌液 疑似阳性菌株培养物进行致病菌PCR鉴定时 应首先将样品液放在密闭离心管中 在100 水域中加热裂解并灭活 再提取核酸 每次离心后 应静置片刻 在生物安全柜中开启离心管 食品病毒检测中核酸提取过程中使用的Trizol reagent对皮肤具有极强的腐蚀性 操作时应戴乳胶手套 细菌 病毒核酸提取时使用氯仿 异丙醇等有机试剂具有一定毒性和挥发性 应佩带一次性手套并在通风橱或通风良好的环境中配制和使用 实验中使用的焦碳酸二乙酯 溴化乙锭具有致癌作用 应戴乳胶或PE手套进行操作 焦碳酸二乙酯具有挥发性 应在通风橱或通风良好的环境中配制和使用 配制焦碳酸二乙酯所使用的吸管 烧杯 试剂瓶等应于121 高压20min后再进行清洗 使用过的含溴化乙锭溶液和琼脂糖凝胶应集中进行无害化处理或上交专业公司处理 六 检测过程 安全操作注意事项 4 有毒有害物质的称量对于微生物检测中会使用一些抑菌剂 其中有些对人体有害 例如 吖啶黄 亚碲酸钾等 在称量过程中粉末状的抑菌剂可能通过呼吸道粘膜或经皮肤接触造成操作者中毒 1 称量一个空的 干净的螺帽容器 2 将预称量的容器和化学试剂瓶拿到通风橱内 3 采取适当的保护措施防止药品与皮肤接触 将所需量的试剂移入预称量的螺帽容器中 并盖住螺帽 4 将已装有化学物质并盖好螺帽的容器放到天平上 称重 5 称量后的总量减去容器的质量得到化学试剂的质量 然后根据化学试剂的质量 计算出配备溶液所需液体的体积 6 将密闭的容器 溶液拿回通风橱 采用适当的保护措施配成所需的化学溶液 六 检测过程 安全操作注意事项 5 装有冻干标准菌株的安瓿的开启食品微生物检测中要使用标准菌株作为日常质控菌株 购买的菌株在开启时应小心操作 防止割伤以及气溶胶感染 应该小心打开装有冻干物的安瓿 因为其内部可能处于负压 突然冲入的空气可能使一些物质扩散进入空气 安瓿应该在生物安全柜内打开 建议按下列步骤打开安瓿 1 首先用75 酒精擦拭 清除安瓿外表面的污染 2 如果管内有棉花或纤维塞 可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹 3 用一团乙醇浸泡的棉花将安瓿包起来以保护双手 然后手持安瓿从标记的锉痕处打开 4 将顶部小心移去并按污染材料处理 5 如果塞子仍然在安瓿上 用消毒镊子除去 6 缓慢向安瓿中加入液体来重悬冻干物 避免出现泡沫 实验室菌种的安全要求 菌株的生物危害程度应与保藏实验室生物防护水平相适应 实验室的装备和管理应符合 病原微生物实验室生物安全管理条例 和GB19489 实验室生物安全通用要求 实验室应制定菌种使用 保藏管理制度和标准化操作规程 应涵盖菌种申购 保管 使用 传代 存储等诸方面 六 检测过程 安全操作注意事项 6 感染性物质 菌种 的储存 包装与运输食品微生物检测中使用的标准 参照菌种 的包装与运输应按照 病原微生物实验室生物安全管理条例 和 人间传染的病原微生物名录 有关规定进行 以食品微生物检测中常见的沙门氏菌属为例 其属于第三类病原微生物 实验活动所需生物安全实验室级别为二级 运输包装分类为B类 具体要求如下 1 运输专用名称为 诊断标本或临床标本或生命物质B类 英文运输专用名称为 Biologicalsubstance categoryB UN编号为 UN3373 2 应有三层包装 第一层包装要求用保存标本的原始容器 外螺旋管 称为主容器 见图1 需将盖口密封 主容器单包装最大运输量液体1L 固体4kg 运输标本的主容器 第二层包装可以采用专用二级包装桶或耐高压塑料袋 称为辅助容器 见图2 应防水 防破损 防泄漏 并含吸收材料 运输标本的辅助容器 吸收材料 第三层包装是将密封好的辅助容器放入运输包装盒 称为外包装 见附图5 最大运输量为液体4L 固体4kg 至少有一个表面 100mm 100mm 运输包装盒要求有保持冷藏低温功能 应含制冷器件 衬垫材料 运输标本的外包装 七 常规消毒 灭菌和去污染方法 清理和清洗 见第一章 物理消毒灭菌法 见第一章 化学消毒法 见第一章 八 废弃物处理 废弃物是指将要丢弃的所有物品 废弃物处理的首要原则 是所有感染性材料必须在实验室内清除污染 高压灭菌或焚烧 用以处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品 在被丢弃前应考虑的主要问题有 1 是否已采取规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒 2 如果没有 他们是否以规定的方式包裹 以便就地焚烧或运送到其他有焚烧设施的地方进行处理 3 丢弃已清除污染的物品时 是否会对直接参与丢弃的人员 或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害 污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序 实验室应建立废弃物处理程序要对感染性物质及其包装物进行鉴别并分别进行处理 相关工作要遵守国家和国际规定 废弃物可以分成以下几类 1 可重复或再使用 或按普通 家庭 废弃物丢弃的非污染 非感染性 废弃物2 污染 感染性 锐器 皮下注射用针头 手术刀 刀子及破碎玻璃 这些废弃物应收集在带盖的不易刺破的容器内 并按感染性物质处理3 通过高压灭菌和清洗来清除污染后重复或再使用的污染材料4 高压灭菌后丢弃的污染材料5 直接焚烧的污染材料 第三部分 化学品 火和电的安全 一 危害性化学品 暴露途径人们可能通过下列方式暴露于危险性化学品 1 吸入2 接触3 食入4 针刺5 通过破损皮肤 一 危害性化学品 化学品的储存实验室应该只保存满足日常使用量的化学品 大量的化学品应储存在专门指定的房间或建筑物内 关于不相容化学品的一般原则为了避免发生火灾和 或爆炸 下表中左边一栏的物质在贮存和操作中应避免接触表中相应的右边一栏里的物质 化学品的毒性作用爆炸性化学品 关于不相容化学品的一般原则 化学品溢出 应配备下列物品 1 化学品溢出处理工具盒2 防护服 例如耐用橡胶手套 套鞋或橡胶靴 防毒面具3 铲子和簸箕4 用于夹取碎玻璃的镊子5 拖把 擦拭用的布和纸6 桶7 用于中和酸及腐蚀性化学品的苏打 碳酸钠 Na2CO3 或碳酸氢钠 NaHCO3 8 沙子 用于覆盖碱性溢出物 9 不可燃的清洁剂 化学品溢出 当发生大量化学品溢出时 应该采取下列措施 1 通知有关的安全官员2 疏散现场的闲杂人员3 密切关注可能受到污染的人员4 如果溢出物是易燃性的 则应熄灭所有明火 关闭该房间中以及相邻区域的煤气 打开窗户 可能时 并关闭那些可能产生电火花的电器5 避免吸入溢出物品所产生的蒸气6 如果安全允许 启动排风设备7 提供清理溢出物的必要物品 参见上面 二 火的危害 在实验室中引起火灾的通常原因包括 1 超负荷用电2 电器保养不良 例如电缆的绝缘层破旧或损坏3 供气管或电线过长4 仪器设备在不使用时未关闭电源5 使用不是专为实验室环境设计的仪器设备6 明火7 供气管老化锈蚀8 易燃 易爆品处理 保存不当9 不相容化学品没有正确隔离10 在易燃物品和蒸气附近有能产生火花的设备11 通风系统不当或不充分 二 火的危害 消防器材应放置在靠近实验室的门边 以及走廊和过道的适当位置 这些器材应包括软管 桶 用于装水和沙子 以及灭火器 灭火器要定期进行检查和维护 使其维持在有效期内 不同类型和用途的灭火器见下表 灭火器的类型和用途 三 电的危害 对所有电器设备都必须定期进行检查和测试 包括接地系统 在实验室电路中要配置断路器和漏电保护器 断路器不能保护人 只是用来保护线路不发生电流超负荷从而避免火灾 漏电保护器用于保护人员避免触电 实验室的所有电器均应接地 最好采用三相插头 实验室的所有电器设备和线路均必须符合国家电气安全标准和规范 四 噪声 长期受过度噪声影响对人体是一种隐患 有些类型的实验室仪器 例如某些激光系统以及饲养动物的设施 能产生显著噪声 造成工作人员的暴露 可以通过噪声检测来确定噪声的危害 在资料显示噪声能控制达标的地方 可以考虑采用工程控制 例如在嘈杂仪器周围或在嘈杂区域与其他工作区域之间采用隔音罩或屏障的方法 在不能控制噪声水平的地方 以及在按常规实验室工作人员会有过度噪声暴露的地方 就要制订听力保护方案 包括在噪声危害区域工作时的听力保护 以及用于确定噪声对工作人员影响的医学监测方案 五 电离辐射 电离辐射的影响 1 对身体的影响2 对遗传的影响电离辐射保护原则1 尽可能减少辐射暴露的时间2 尽可能增大与辐射源之间的距离3 隔离辐射源4 用非放射测量技术来取代放射性核素 保护性措施 略 放射性核素工作的安全操作规范 略 第四部分实验室安全应急程序 一 意外事故应对方案 意外事故应对方案应当提供以下操作规范 1 防备自然灾害 如火灾 洪水 地震和爆炸2 生物危害的危险度评估3 意外暴露的处理和清除污染4 人员和动物从现场的紧急撤离5 人员暴露和受伤的紧急医疗处理6 暴露人员的医疗监护7 暴露人员的临床处理8 流行病学调查9 事故后的继续操作 在制定意外事故应对方案时应考虑以下几方面问题 1 高危险度等级微生物的鉴定2 高危险区域的地点 如实验室 储藏室和动物房3 明确处于危险的个体和人群4 明确责任人员及其责任 如生物安全官员 安全人员 地方卫生部门 临床医生 微生物学家 兽医学家 流行病学家以及消防和警务部门5 列出能接受暴露或感染人员进行治疗和隔离的单位6 暴露或感染人员的转移7 列出免疫血清 疫苗 药品 特殊仪器和物资的来源8 应急装备的供应 如防护服 消毒剂 化学和生物学的溢出处理盒 清除污染的器材物品 二 微生物实验室应急措施 1 手套的损坏 污染1 手套被污染时应立即用消毒剂喷洒手套 2 脱下手套 放入黄色垃圾袋内 待消毒 脱手套的方法为 a 用一手捏起另一只手套近手腕处的外缘 b 将手套从手上脱下并将手套外表面翻转入内 c 用戴着手套的手拿住该手套 d 用脱去手套的手指插入另一手套腕部内面 e 脱下该手套使其内面向外并形成一个由两个手套组成的袋状 f 丢弃在高温消毒袋中待消毒处理 g 更换新手套继续实验 注意 以上操作要远离面部 二 微生物实验室应急措施 2 衣物污染1 尽快脱掉最外层防护服 并注意防止感染性物质进一步扩散 2 将已污染的防护服放入黄色垃圾袋内 待高压灭菌 3 脱掉手套 到污染区出口处洗手 4 更换防护服和手套 5 必要时对发生污染及脱防护服的地方进行消毒处理 如果内衣被污染 应立即脱掉已污染的衣物 消毒处理 二 微生物实验室应急措施 3 感染性物质溅洒污染皮肤及粘膜a 感染性液体 主要指增菌培养液 外溢到皮肤 应立即停止工作 脱掉手套 用75 的酒精进行皮肤消毒 再用大量水冲洗 手部清洗消毒的方法 应推荐使用肘动式或自动式洗手开关 用流动水冲洗手部多次 然后用液体皂滴在手上 反复撮手 再用水彻底冲洗 动作轻揉 水不要开的太大 清洗完毕 用干净的纸巾或手巾擦干 可以用75 的酒精擦手来清除双手的轻度污染 在没有洗手池的地点 可以使用含酒精的 免洗 手部清洁产品替代 b 感染性液体溅入眼睛 应立即停止工作 脱掉手套 迅速到缓冲区用洗眼器冲洗 再用生理盐水冲洗 注意动作轻柔 勿损伤眼睛 洗眼器的使用方法为 取下洗眼器罩 受感染者的眼睛部位摆放到冲眼器花洒正上方 将洗眼器开关打开 洗眼器花洒即有清水喷出 以上两种情况都应做适当的预防治疗和医学观察 并报告实验室安全员进行事故记录 二 微生物实验室应急措施 4 刺伤 切割伤或擦伤应急处理要保持镇静 立即停止实验 脱掉手套 用清水和肥皂水清洗伤口 尽量挤出伤口处的血液 取出急救箱 用碘酒或75 的酒精擦洗伤口 适当的包扎 及时就医 告知医生受伤原因及可能的微生物污染 必要时要进行医学处理 二 微生物实验室应急措施 5 潜在危害性气溶胶的释放操作中生物安全柜突然停机或转为正压 大量感染性物质溢出 溅洒 非封闭离心桶的离心机内带有感染性物质的离心管发生破裂都有可能造成气溶胶的释放 此时所有人员必须立即撤离相关区域 报告实验室安全员 在1小时内任何人不得进入事发实验室 以使气溶胶排出和重粒子沉降 无中央通风系统则应推迟进入 如24小时 贴出标识以示禁止入内 过后由专业人员指导清除污染 如甲醛蒸汽熏蒸 操作时注意防护 暴露人员应进行医学观察 必要时及时就医 二 微生物实验室应急措施 6 生物安全柜内溢洒当生物安全柜内发生溢洒时 处理溢洒物不要将头伸入安全柜内 也不要将脸直接面对前操作口 而应处于前视面板的后方 选择消毒剂时需要考虑消毒剂对生物安全柜的腐蚀性 使用含氯制剂后再用清水擦拭 当溢洒的量不足1mL时 可直接用消毒剂浸湿的纸巾 或其它材料 擦拭 使用消毒剂时 要从溢出区域的外围开始 向中心进行处理 当生物安全柜内大