脐血干细胞的生产与作用脐血干细胞的生产与作用生产生物技术及应用.doc

江苏农林职业技术学院毕业设计（论文）SNL/QR7.5.4-3脐血干细胞的生产与作用专业 生物技术及应用学生姓名 江晔班级 06生物技术及应用(1)学号 061401109指导教师 刘远完成日期2009年6月4日- 5 - / 14成绩评议学号061401109姓名江晔题目脐血干细胞的应用指导教师建议成绩：评阅教师建议成绩：答辩小组建议成绩：院答辩委员会评阅意见及评定成绩：答辩委员会主任签字（盖章）：年月日毕业设计（论文）任务书姓名江晔学号061401109班级06生物技术及应用1班题目脐血干细胞的生产与作用设计(论文)主要内容脐血干细胞的分离冷冻技术与脐血干细胞在各个领域所发挥的作用。重点研究问题脐血干细胞分离冷冻的技术主要技术指标脐血经过分离后有核细胞的回收率达到85%以上，红细胞的去除率达到50%以上。其它要说明的问题脐血在冷冻时防冻液的加入必须在2分钟内完成，且加入前必须预冷到4以下。指导老师意见指导教师签字：年月日指导教师意见对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩优良中及格不及格指导教师签字年月日评阅教师意见对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩优良中及格不及格评阅教师签字年月日答辩小组评议意见学号061401109姓名江晔题目脐血干细胞的生产与作用答辩小组意见：1、对论文的评价2.建议成绩等级优良中及格不及格3.需要说明的问题答辩小组长签字年月日脐血干细胞的生产与作用江苏农林职业技术学院 06生物技术1班 江晔摘要：本文介绍了脐血干细胞生产上的技术与脐血干细胞在医学上的作用。从脐血干细胞的分离冷冻入手介绍了这一前沿科技，从脐血干细胞在医疗方面的作用表达了脐血干细胞移植作为一种新型医疗方式的巨大功效。关键词：脐血干细胞；干细胞的分离与冷冻；疾病治疗；抗衰老；Application of umbilical cord blood stem cellsAbstract: In this paper, the production of cord blood stem cells in umbilical cord blood stem cell technology and the role of medicine. From umbilical cord blood stem cells from frozen start to introduce the cutting-edge technology, from the umbilical cord blood stem cells in medical expressed the role of cord blood stem cell transplantation as a great new way of the effectiveness of health care.Keywords：Cord blood stem cells; disease treatment; anti-aging; stem cell isolation and frozen目录 前言 本课题的提出1 1 定义：干细胞11.1脐血干细胞的作用1 1.2脐血干细胞的分离和冷冻22 结论4 3 讨论5 3.1冷冻液对脐血的作用及危害5 3.3离心对分离的影响5 3.4程控降温对细胞的影响5 4 干细胞的前景与展望5 参考文献6 干细胞是一种神奇的细胞，它可以分化成各种组织细胞，身体的各个部分全部是由干细胞分化而来的。所以干细胞可以治疗很多疾病。脐带血中的干细胞含量最高，把脐血中的干细胞分离出来放入液氮罐中冷冻可以保存最少十年，自体的还可以避免自身的免疫排斥反应。脐血干细胞的移植在医学领域扮演着一个万能药物的角色，它可以治疗白血病，先天性红斑狼疮等罹难病症，并且脐血干细胞还可以应用于保健行业简单的说就是可以活化细胞延缓衰老提高人体免疫力等效用。可以说干细胞在人体中的应用达到了一个其他化学类药物所无法企及的高度。干细胞的分离技术是其应用于各个领域的基础。1.定义：干细胞(stemcells,SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。所以干细胞才可以治疗很多罹难杂症，创造奇迹，让病人重获健康。脐血干细胞：是刚出生的婴儿的脐带血中所含的一类干细胞，其分化程度最低，并且对移植者的免疫排斥反应低，在生能力也比成体的干细胞高很多，因此成为干细胞移植的新生宠儿。但脐血中的红细胞太多，直接打入病人身体中会增加病人身体的负担加重病情所以干细胞的分离就是要去除多余的红细胞，随着HES分离技术的诞生可以把大部分的红细胞去除才使得脐血干细胞可以应用于临床。脐血干细胞的基础和临床研究1在最近的一、两年中获得了快速的发展,对脐血干细胞的生物学特性、采集与冻存、体外扩增及其临床使用情况进行研究有利于其更广泛地应用.1.1脐血干细胞的作用脐血分离后，其有核细胞的回收率可以达到85%以上，而红细胞的含量可以降低到50%以下，经过几天的培养就可以移植入病人体内，虽然HIV没有配型提高了移植的难度，但由于脐血干细胞的低免疫排斥反应所以病人的身体是可以接受的。脐血的来源比骨髓要广泛的多，并且脐血干细胞是打入静脉血中的，这样就免除了手术的风险和来源的困难，使更多的病人得到及时的治疗。脐带血干细胞移植(HSCT)是目前治疗难治性血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤的主要手段之一，而脐带血作为造血干细胞HSCs)的重要来源，自1988年Gluckman等采用脐带血移植(UCBT)成功地治疗了l例患Fanconi贫血的5岁儿童以来，目前临床上采用脐带血移植治疗的疾病已经达到8O余种，治疗的患者(包括儿童、成人)全世界已超过6000例J大量的基础研究和临床实践显示脐血移植优势明显2。对于脐血等成体干细胞移植的临床应用前景，国际医学权威杂志(TheNewEnglandJournalofMedicine)和(Blood)杂志曾对此做过全面的综述“。UCBT现阶段可治疗的疾病血色素与血液异常巨细胞缺乏性血小板减少症(AMT)，再生障碍性贫血，先天性血球细胞缺乏症，镰状细胞性贫血，地中海性贫血，BlackfanDiamond贫血，Evan综合征，Fancon贫血，Kostmann综合征疾病急性淋巴细胞性白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，急性非淋巴细胞性白血病(ANL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性骨髓细胞性白血病(CML)，年青型骨髓单核细胞性白血病(JML)，骨髓发育不良综合征(MDS)，多发性骨髓瘤。体性肿瘤脑瘤，何杰金病，非何杰金淋巴瘤，Ew。ng肉瘤，生殖细胞肿瘤，神经母细胞瘤,卵巢癌，小细胞性肺癌，睾丸癌。先天性代谢性缺陷脑白质肾上腺营养不良症，淀粉样变性，巴尔淋巴球综合征，先天性角化不良，家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增生症，Gaucher疾病，Gunter疾病，Hunter综合征，Hurler综合征，遗传性神经元蜡样脂褐质沉着症，Krabbe疾病(婴儿遗传性脑白质萎缩)，Langerhan细胞组织细胞增生症，LeschNyhan疾病，骨硬化病(骨质石化病)，白细胞黏着缺乏症。免疫缺陷病变腺嘌呤去氨酵素缺乏(ADA)，慢性肉芽肿疾病(CGD)，严重性联合免疫缺陷疾病(SCIDs)，X一性连锁性淋巴组织增生疾病(KLP)，WiskottAldrich症候。自体免疫疾病多发性硬化症，风湿性关节炎，红斑性狼疮3。1.2脐血干细胞的分离和冷冻现在库存分离干细胞最广泛的方法是HES（羟乙基淀粉）沉淀分离法4。可以有效的去除多余红细胞，保留绝大多数的有核细胞。从而达到临床应用的标准。而冷冻主要是往分离后的脐血中加入DMSO和右旋糖苷配置的防冻液后迅速把温度降低至零下180并转移至液氮罐中保存。1.2.1库存脐血干细胞的分离41、器材5ml，10ml，15ml，20ml,30ml,50ml的注射器，EP管，10ml软试管，100ml转移袋，50ml冷冻袋，止血钳，灭菌剪刀，超净工作台，血浆夹，热合机，电子秤，酒精灯，碘酒，75%酒精，医用棉签，细菌培养瓶，HES，离心机，天平2、步骤第一步离心 把血液放入超净工作台中。用止血钳夹住皮管，并用碘酒擦拭要剪开的部位擦拭完后用酒精脱碘。用灭菌剪刀剪开止血钳上部的皮管，取1ml的血液用做有核细胞的读数和血型检测。抽取HES打入血液中，抽取的量约为血液总量的五分之一。把混合后的血液转移至100ml转移袋中，放入离心机中离心7分钟，离心的时候袋口部位朝下以利于离心后抽去红细胞。第二步离心，走离心机中取出血液，取的时候尽量避免震荡以免破坏分层。血液分离后分为三层，上层为透明状的血浆，中层为半透明的红细胞与有核细胞的混合体，下层为沉淀的红细胞。用止血钳夹住转移袋顶端并挂在超净台的顶部使其悬空。用止血钳夹住皮管，按无菌抄作规范剪开止血钳下部，抽去沉淀的红细胞，抽去的量最少是加入HES的量。热合剪开部位放入离心机中离心21分钟。去除多余血浆， 走离心机中取出血液，取的时候尽量避免震荡以免破坏分层。这步离心后分为三层，上层为透明状的血浆，中层为有核细胞层，下层为剩余红细胞与有核细胞的混合层。把离心后的血液放入血浆夹中，缓慢夹紧以避免有核细胞的腾起所造成的损失。用止血钳夹住皮管，按无菌操作剪开皮管，缓慢打开止血钳放出多余气体。用注射器抽取15ml血浆打入细菌培养瓶中检测是否染菌。抽去多余血浆只留下32ml的血液。用无尘布轻轻擦拭转移袋外部，把内部贴壁的有核细胞擦下。混匀后用注射器抽去0.6ml用作读数。有核细胞回收率的计算数据如表(1)表1 有核细胞回收率的计算数据血液含量有核细胞每ml含量分离前146ml5.71012分离后32ml20.81012有核细胞回收率=（20.8101232）(5.71012 146)87%1.2.2库存脐血干细胞的冷冻配置防冻液 抽取右旋糖酐8ml打入转移袋中，放入冰水混合物中冷却5分钟，抽取8mlDMSO缓慢打入转移袋中，混匀。冷却7分钟。防冻液与血液混匀 把血液放入冰水混合物中冷却7分钟。用注射器抽出防冻液往血液中加入，加的时候要特别缓慢，加一次需要摇50秒左右，使温度始终在4以下。血液的转移 血液加入防冻液后冷却7分钟。用50ml注射器抽出血液，打入防冻袋中。排出防冻袋中的气泡。这里要注意从抽出血液开始到排出气泡为止不能超过两分钟。程控降温 把冷冻袋中的血液与冰水混合物一起放入传递窗。外部人员打开程控降温仪，把血液放入程控降温仪中开始程控降温。首先调试温度，当配型管中的温度与箱体内部温度保持恒定时放入血液。点下开始按钮。结束时血液温度为-80，迅速拿出血液转移至液氮罐中保存。冻存的脐血干细胞可以保存1020年之久，当婴儿长大需要用的时候只需要把冻存的脐血复苏后培养12天就可以使用。相当于买了份生命保障，尤其是自体的脐血干细胞治愈几率大大提高。此外脐血干细胞从采集时间起24小时内分离后经23天的培养可以直接用于临床。1.2.3临床用脐血干细胞的分离器材准备 50ml离心管，5ml移液管，10ml移液管，10ml软试管，细菌培养瓶，生理盐水，淋巴分离液，红细胞裂解液，培养瓶。第一次离心 把脐血放入超净工作台，按无菌操作剪开皮管，把脐血分装入离心管中1000r每分钟离心10分钟。第二次离心 去上清液，加生理盐水至刻度45ml，用移液枪混匀，用移液枪抽取混匀的血液转移至放有淋巴分离液的离心管中。放入离心机中2000r每分钟离心21分钟。因为红细胞比淋巴分离液重而有核细胞比淋巴分离液轻，所以这一步可以去掉大部分的红细胞。第三次离心 离心后的血液分为四层，第一层是血浆，第二层呈雾状为有核细胞层，第三层为淋巴分离液层，最下层是沉淀的红细胞层。用移液枪深入有核细胞层按画圈的方法把有核细胞转移至新的离心管中，加生理盐水混匀，放入离心机中1000r每分钟离心10分钟。第四次离心 离心后有核细胞与剩余的红细胞沉淀在底部，倒去上层液体加红细胞裂解液进行裂解，裂解时间不能超过45秒否则会使有核细胞死亡。加生理盐水至刻度45ml混匀放入离心机中1000r每分钟离心10分钟。第五次离心 倒去上层液体，加生理盐水至45ml混匀放入离心机中1000r每分钟离心10分钟。第六次离心 取上清加入细菌培养瓶中检测是否染菌。重复第五次离心。细胞培养 每个培养瓶中放15ml的液体培养基。把得到的有核细胞与生理盐水混匀分装入培养基中，用移液枪混匀，放入二氧化碳培养箱中培养。有核细胞与生理盐水混匀后取0.6ml留作读数。如果检测出染菌则丢弃。检测合格的培养25天就可做临床发放了。一般一个成年人需要注射的有核细胞数量不小于5.6108。2.结论我国的脐血干细胞的技术还处于发展阶段，对于某些生产环节还比较模糊，全国范围内的标准还没有明确，应用于临床的脐血干细胞也会发生染菌造成患者病情加重，但要知道我国干细胞科技发展也不过四五年之久，速度已经相当快速了，这就造成细节不是太完善，需要改进的地方还很多。干细胞库的建立改善了干细胞移植途径的渠道，而婴儿保存脐带血也将成为一种产业，我国人口众多使干细胞库的建立已经刻不容缓。 脐血干细胞在医疗上的应用越来越广泛，南京，深圳等大城市都建立起了干细胞移植的点，随着干细胞对疾病治疗的不断发展更多的点都会建起。相信在不久的将来干细胞移植将为大众服务，治疗疾病，延缓衰老真正的成为一种万能药物。3讨论3.1冷冻液对脐血的作用及危害防冻液是由DMSO与右旋糖酐按1：1配置的。其中DNSO是高效渗透物质，右旋糖酐可以最大程度降低超低温对细胞的伤害，两种混合配置的防冻液可以渗透入细胞内部达到防冻效果。但DMSO在4对细胞有剧毒，所以对操作的需求很高。现阶段降温的手段还是冰水混合物降温。在细胞复苏的时候是用生理盐水洗出细胞中残留的DMSO，如果没把DMSO洗出则会造成细胞大量死亡。3.2离心对分离的影响5离心时会产生高热，有核细胞非常脆弱，一点温度的差异都会对细胞活力产生影响。所以离心前需要先把离心机降温。不同重量的脐血所需的离心条件都不同，但生产需要考虑效率这样就把离心条件规定死了，这样就使得重量高的脐血离心效果一直不是太好，主要表现在分层不够明显，溶血等，造成有核细胞的回收率降低。所以离心条件需要有几个规范，而不是就一个规范。3.3程控降温对细胞的影响6降温还是围绕DMSO。前期温度不能超过4。降温分为7步。箱体内有对照管，代替血液成分使降温更准确。首先对照管温度从4降到-5开始第一步，第二步箱体温度升高到23，这一步有时升高幅度过大，超过3就会对细胞造成影响。第三步箱体温度降到-5，第四步箱体温度降到-20，第五步对照管温度降低到-40，第六步对照管温度降到-80，第七步结束。拿出血液放入液氮罐中。4.干细胞的前景与展望现在我国的干细胞库还不是十分健全，还保留在全人工阶段，而美国的干细胞库已经全自动化，大部分的婴儿都保留了脐血干细胞，这样就使得健康得到了保障。自动化后的脐血干细胞库可以保存的脐血与复苏后的使用成功率都大大的提高了，我国13亿人口每年要有多少的婴儿出生!这是多么大的一个市场啊，前景将不可限量。 干细胞的应用非常广泛，21世纪人们的生活理念都倾向于健康与美丽。而干细胞不仅仅是应用于医疗，其分化成各种组织细胞的能力完全可以改善人体细胞的活力，提高免疫力，活化皮肤细胞，活化头皮细