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细胞化学技术 1 组织化学技术 应用化学 物理 生物化学 免疫学或分子生物学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术 能在组织切片定性 定位地显示某种物质的存在与否以及分布状态 还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度 获得定量的信息 细胞化学技术 应用组织化学技术于游离细胞的样品 如细胞涂片 则称细胞化学技术 2 一组织细胞化学染色 组织细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科学 它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下 运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构及生理活性物质原位地显示 因而对于探索化学成分 生理功能 新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的意义 组织细胞染色的范围一般可分为 蛋白质类 氨基酸 核酸类 多糖类 脂类 盐类或金属类 采用的方法通常为化学结合物理溶解显示及酶 底物反应 3 组织细胞化学染色方法分门别类有许多种 结果的显示也不尽相同 有时即使是检测同一物质 因采取的方法不同 其结果有可能存在一定的偏差 另一些是由于方法学上本身的缺陷 其结果也可能产生误差 所以我们应注意选择结果稳定 方法简便 操作步骤越繁复 结果出现误差的可能性就越多 阳性显示明显的细胞化学染色方法如果条件允许可与细胞免疫化学 细胞遗传学 分子生物学等相结合 使细胞化学染色发挥最大 最准确的作用 4 常用组织细胞化学染色 过氧化物酶peroxidase POX 1 原理血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧 后者可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处 2 正常阳性细胞 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性 5 单核细胞呈弥散弱阳性 中性粒细胞呈粗颗粒强阳性 6 过碘酸一雪夫反应periodicacidSchiffreaction PAS 此试验中能被过碘酸 雪夫反应呈阳性的多糖类物质有糖原 粘多糖 糖蛋白 糖脂 还包括一些磷脂类物质等 因此PAS阳性不能简单地就表明有糖原的存在 只是在对血细胞的组织化学研究中通常习惯于将PAS阳性认同于糖原 PAS染色虽然不完全代表糖原 但在血液系统疾病特别在各类型急性白血病中却有相当大的应用价值 PAS染色若结合其他化学染色和细胞免疫表型检测可对部分疾病的诊断和鉴别诊断提供一定的价值 7 1 原理过碘酸氧化多糖类中的乙二醇使之成为双醛基 后者与无色品红结合形成紫红色化合物 定位于含多糖类的细胞质内 多糖类物质含量决定了色泽的深浅 2 参考范围 正常阳性细胞 粒细胞系 原粒细胞多呈阴性 通常随细胞不断成熟阳性反应由弱渐强 至细胞完全成熟后达到最大强度 其中中性粒细胞呈胞浆内弥散状红色阳性 嗜酸粒细胞S颗粒之间的胞浆呈红色阳性 嗜碱粒细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性 8 红细胞系 幼红细胞及红细胞均呈阴性 巨核细胞系 从原始阶段到血小板均呈阳性 淋巴细胞系 大多数淋巴细胞呈阴性 小部分淋巴细胞成阳性 单核细胞系 原始阶段呈阴性 幼稚阶段以后可见浆内呈弥散细小颗粒状红色阳性 浆细胞系 大多数浆细胞呈阴性 小部分浆细胞呈阳性 9 中性粒细胞碱性磷酸酶neutrophilalkalinephosphatase NAP 1 原理细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚 使之释放出萘酚 后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物 定位于酶活性所在处 2 参考范围 中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围2 56 积分4 80分 100个中性粒细胞 10 NAP染色结果 固紫 B 11 二组织细胞免疫化学标记技术 组织细胞免疫化学是细胞化学吸收了免疫学的理论和技术而发展起来的一门重要方法学 在现代医学领域中被广泛应用 尤其在组织细胞学中该技术的应用是微观世界形态学研究从单一的形态学描述上升到结构 功能和代谢为一体的动态观察 并可对细胞的属性 分化阶段和变异进行鉴别 有助于临床疾病的诊断 12 组织细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅为短短30年左右的时间 但其发展异常迅速 检测方法可多达20多种以上 其基本原理是将组织和细胞作为抗原 与其相应的特异抗体产生抗原 抗体反应 并借助荧光色素 酶 胶体金 铁蛋白等显示系统 在被测组织和细胞所相应的位置显示出来 由于抗原 抗体系统具有高度的特异性和敏感性 能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来 进行观察和分析 13 目前实验室常用的方法有免疫荧光法 PAP法 ABC法 IGSS法等10大类 但由于各种方法均有其特性和检测适应范围 即某一种方法无法在所有的检测标本中被应用 我们应充分发挥各种方法上的特点 有选择性的将不同来源的组织和细胞标本并选用不同的方法来进行检测 使我们的检测结果更精确 14 一 免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微显示的精确性相结合 用已知的抗体在不影响其免疫学特性的前提下与荧光素相结合 然后将结合了荧光素标记的抗体作为一种标准试剂 对被检细胞进行检测和鉴定 并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光 可以直接观察被检测中有否特异荧光的表达 目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 FITC 四乙基罗丹明 RB200 四甲基异硫氰酸罗丹明 TRITC 及藻红蛋白 PE 在流式细胞术 FCM 中较常用 较为经典的方法有下列几种 15 一 直接法是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应 依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别 该法的优点为简单特异 但其缺点也很明显即敏感性较低另需制备大量特异性的荧光抗体 二 间接法间接法采用抗球蛋白试验原理 先制成荧光素标记抗抗体 检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间后 充分洗去未结合的游离特异性抗体 然后添加荧光素标记抗抗体使之形成被检抗原 抗体 荧光素标记抗抗体复合物 由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光标志物 所以其敏感性比直接法要高 16 组织切片 组织切片 直接法 间接法 Ab1 荧光 Ab1 Ab2 荧光 免疫荧光法原理图 17 三 补体法这是一种间接法的改良 既在抗原抗体反应时加入补体 然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原 抗体 抗补体荧光抗体复合物 此法敏感性较高 但其较易出现非特异性染色 而且操作过程相对较复杂 四 双标记法运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特点 将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体 可在同一标本上测定不同的抗原 此法即可采用直接法也可用间接法进行 若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体 甚至可进行三重或多重标记法 18 单色荧光染色 19 双色荧光染色 20 MAL萤光标记 黄 CD19 红 CD13 21 多色荧光染色 22 二 免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是将抗原 抗体反应的特异性与酶的高效 快速催化作用彼此结合 由此形成一种既具有免疫荧光 放射免疫的优点 又避免了他们的缺点 这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处 所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物 并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否 选用的标记酶有辣根过氧化物酶HRP 碱性磷酸酶 AP 葡萄糖氧化酶 GOD D半乳糖苷酶 D Gal 等 以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且部分已制成试剂盒出售 目前已广泛地被临床和实验室所应用 23 细胞 二步酶标法 三步酶标法 Ab1 酶基团 Ab1 Ab2 酶基团 免疫酶标法原理图 24 一 辣根过氧化酶免疫酶标记法 辣根过氧化酶是从辣根中提取的一种糖蛋白 其作用底物为供氢体和过氧化物 目前常用的供氢体为二氨基联苯胺 DAB 在酶反应过程中DAB不断供给复发物电子 使其成为在光镜下能观察到的不溶性深棕色多聚合物 定位与酶活力处即抗原 抗体反应部分 现常用的方法有 直接法 间接法 抗体 桥联法 过氧化酶 抗 过氧化酶复合物法 PAP 亲和素 生物素 过氧化酶复合物法 ABC 等 在组织细胞相关抗原检测中通常使用PAP法和ABC法这两种 25 二 免疫碱性磷酸酶标记法碱性磷酸酶是一种磷酸酯的水解酶 从大肠杆菌中提取的此酶最适PH为8 0左右 其作用的底物有磷酸萘酚AS MX和磷酸萘酚AS BI 显色的偶联剂可采用固红 GBC和固蓝 BB等 免疫碱性磷酸酶染色方法很多 有直接法 间接法 APAAP法 ABC AP法 但APAAP法和ABC AP法二种 较为常用 且这二种方法其敏感性和特异性均较满意 26 细胞 Ab 1 Mo Ab 2 Ho Ab 3 Mo 免疫酶桥联 APAAP 法染色原理 27 Ab 1 细胞 生物素化二抗 ABC复合物 生物素化Biotion HRP AP ABC法染色原理图 卵白素 Avidin 28 三 多聚螯合物法 ELPS 一 多聚螯合物法的特点多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术 其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物 此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术 更由于酶连接方式较为直接 可进一步降低操作时一抗的工作液浓度 可使反应更灵敏 整个背景染色更低 染色时间短等特点 目前在临床上 特别是临床病理被广泛应用 该法也可分为一步法和二步法 一步法是将多聚物酶分子直接结合在特异性一抗上 而二步法是将多聚物酶分子连接在第二抗体上 29 细胞 Ab 1 酶基团 HRP AP 聚合物支架 ELPS法染色原理 一步法 30 细胞 Ab 1 Ab 2 酶基团 HRP AP 聚合物支架 ELPS法染色原理 二步法 31 32 在被检细胞周围 或细胞内 见到红色沉淀物 即为阳性反应 CD13 33 组织细胞免疫化学操作方法要点 1 固定 涂片固定应根据各种标本的不同而进行 2 预处理 封闭非特异性位点和阻断内源性酶 3 加单抗 添加工作浓度一抗置室温 25 通常30 60分钟左右 4 加二抗 添加工作浓度二抗置室温 25 通常30 60分钟左右 5 显色 添加相应荧光剂或酶底显色剂5 10min 6 观察 荧光法应采用荧光显微镜选取相应波长进行观察 酶标法经复染后用普通显微镜观察即可 34 三 复合免疫组织细胞化学染色 随着免疫组织细胞化学技术广泛地被采用的同时 在技术方法上的要求 也日趋提高 有时单一的免疫组织细胞化学技术已不能满足临床的要求 这时就可采用二种或二种以上的免疫组织细胞组织化学技术 如为能检出细胞内的微量抗原 可采用重复强化技术和桥联 亲和素技术 若需检测同一组织或细胞上不同的抗原 可采用双重或三重染色技术 以此来提高检测的准确性 为疾病的诊断提供更重要的依据 35 一 PAP和ABC HRPPAP和ABC HRP均属免疫酶标记技术 且都带有辣根过氧化酶基因 将这两种技术连续应用于一张涂片上 可提高检测的敏感性和微量抗原的检出率 其基本原理先进行PAP技术 再用生物素化二抗与其结合 最后连接ABC复合物 经过这两次技术可使微弱的原始信号得到比应用一种技术更大的放大效果 二 免疫荧光技术和免疫荧光技术利用不同荧光素在激发光下呈现不同颜色这一特点 如异硫氰酸呈黄绿色 异硫氰四甲基罗达明显红色 若将这二种荧光素采用不同的方法同时标记在同一细胞上 用荧光显微镜换茬时 调节不同荧光素所需的特定波长的光波 就可以检测不同的抗原成分 36 三 免疫荧光技术 免疫酶标记技术将这二种技术联合应用 有其独特的一个方面就是对双重或三重染色结果观察较为清晰 目前双重染色有时采用免疫酶标记和免疫酶标记技术 虽然免疫酶标记技术所携带的标记酶类有许多种 酶反应所需的底物基质液和偶联剂品种也很丰富 在双重标记技术中可选用一些显示色差异较明显的显色系统 但往往由于颜色间相互重叠而产生观察结果时的困难 再由于反复多次地进行酶底物显色 造成背景染色偏深且存有一些难以去除的杂质 影响结果的观察 而免疫荧光技术 免疫酶标记技术若只作二重染色 那只有一次酶底显示 其背景相对要清晰 更有意思的是观察同一细胞上有否二种抗原同时存在 只需调节光源即可 打开普通光观察免疫酶标结果 同样打开荧光光源可观察免疫荧光的结果 无需使用移动尺 37 四 免疫酶技术 免疫酶技术由于用做标记物的酶有多种 他们又各自有许多不同的酶底物 即使同一酶底物也可以显示多种不同的颜色 反应的显色沉淀物相对较稳定 所以双 多量免疫酶染色可挑选的余地相当大 在双 多重免疫酶标记染色中选择同一种酶体系的称单酶双 多重标记染色 而选择二种酶体系的称双酶双 多重标记染色 单酶和双酶双 多重免疫染色 这二种方法的选用 各自实验室可根据其检测的项目和试剂来源而加以选择 38 四 影响免疫细胞化学技术的因素 免疫细胞化学技术中所应用的方法较多 反应原理和所选用试剂也不尽相同 从各种标本的制备 抗体的稀释 孵育的时间 结果的观察等许多方面均有其特定的操作要求和顺序 其中无论哪一环节处理不当 就可使测定的结果发生误差 一 免疫荧光细胞化学技术1 准备整个操作过程中所使用的器皿如载玻片 试管 盖玻片等必须清洁光滑 不含自发荧光 且载玻片以薄为好 应小于1 2mm 否则厚玻片能吸收较多光源 激发光可主动在被检标本上聚集 39 2 观察部位选择若要在载玻片上标出标本所在区域 可用DaKo标记笔圈出 如用荧光型效果更好 此法即可表明细胞所在位置 便于观察 又可防止试剂外溢 节约成本 3 封片封片剂需选用无色透明 无自发荧光 且在pH8 5 9 5时有较强荧光亮度 4 细胞涂片细胞涂片最理想的是采用离心涂片机进行涂片 并调整好细胞悬液浓度 可使细胞分布均匀 若采取手工涂片要控制好涂片厚薄 不宜太厚 以免细胞过分重叠 影响结果观察 40 5 显微镜摄影用荧光显微镜浸油镜观察细胞时 所采用的油应同样无自发荧光 若需同时作显微镜摄影 最好选用显微摄影专用油 以免图像清晰程度受影响 6 荧光灯的使用荧光显微镜每次使用时间不宜太长 以1小时以内 超过90min 高压氘灯的发光强度下降 荧光减弱 影响结果观察 另标本经紫外线照射15min后 荧光亦明显减弱 7 标本的保存由于荧光素很易衰退 染色标本应及时观察 若不能马上观察 可将标本放在聚乙烯塑料袋中4 保存 可延缓荧光减弱时间并可防止封片干燥 41 8 对照的选择免疫荧光染色每次均应该设对照染色 如阴性对照 阳性对照 染色抑制试验 自发荧光对照 直接法时尚需作与特异性抗体同种属源性正常血清对照 9 非特异性荧光的区别观察结果时应区别特异性荧光和非特异性荧光 因免疫荧光染色有时还出现一些与抗原反应无关的荧光 造成非特异性荧光的原因很多 如抗体不纯 荧光素质量差 标本洗涤时间不够 未结合的游离抗体未清洁干净等 届时应结合产生非特异性荧光的具体原因加以去除 42 二 免疫酶细胞化学技术1 标本选择的特点免疫酶标法可选择组织切片或骨髓涂片也可抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取出单个核细胞 采用涂片机涂片 2 标本的保管标本采集后至结果观察完毕以前 应尽可能避免接触与实验无关的化学物品 特别是苯 二甲苯 醚 乙醇 双氧水 醛等实验室常用试剂 使细胞表面的分化抗原减少 甚至失去 造成假阴性 3 试剂的准备各种试剂购进后 特别是单克隆抗体 除参考产品说