质粒DNA的提取和鉴定.ppt

第一部分碱裂解法提取质粒 一 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒 提纯的思路 质粒的特性 共价 闭合 环状的小分子量DNA要去除的物质 蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA 二 实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们 在碱性pH DNA变性 恢复中性时 线性染色体DNA不能准确复性 与其它大分子共沉淀 而质粒DNA却可以准确复性 留在上清中 碱性下 变性蛋白是可溶的 酸性 中性下变性蛋白不溶而沉淀 几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性 由于操作原因提取的质粒可有三种结构 超螺旋 开环和复制中间体 即没有复制完全的两个质粒连在了一起 三 实验仪器 材料与试剂 一 仪器 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 二 材料 含有质粒的大肠杆菌 LB液体培养基 三 试剂 溶液I50mM葡萄糖25mMTris HCl pH8 0 10mMEDTA溶菌酶4mg mL作用 分散细胞 鳌合金属离子使金属酶失活溶液II0 2MNaOH1 SDS 新鲜配制 作用 碱性下水解细胞壁肽聚糖 核酸和蛋白质变性 溶液III5MKAc作用 酸性下质粒DNA复性 变性蛋白 SDS 线性DNA沉淀 K 可中和DNA 沉淀SDS 平衡酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 作用 氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离 平衡酚pH7 8 酸性下DNA分配于有机相 酚的密度大 可使DNA在上清中 异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫 注 用时取下层液 酚腐蚀性强 可引起灼伤 无水乙醇 除去DNA水化层 使DNA沉淀TE缓冲液 溶解DNA 三 实验仪器 材料与试剂 1 取1 5ml培养液倒入1 5mleppendorf管中 4 下10000rpm离心5分钟 2 弃上清 将管倒置于滤纸上数分钟 使液体流尽 3 菌体沉淀重悬浮于100 l溶液 中 需剧烈振荡 室温下放置5 10分钟 4 加入新配制的200 l溶液 盖紧管口 快速温和颠倒eppendorf管数次 以混匀内容物 千万不要振荡 冰浴5分钟 5 加入150 l预冷的溶液 盖紧管口 颠倒混匀至出现白色絮状沉淀 温和振荡10秒 使沉淀混匀 冰浴中5 10分钟 4 下12000g离心15分钟 四 操作步骤 四 操作步骤 6 上清液移入干净eppendorf管中 加入等体积的酚 氯仿 1 1 振荡混匀 4 下12000g离心5分钟 7 将水相移入干净eppendorf管中 加入2倍体积的无水乙醇 振荡混匀后置于 20 冰箱 冰浴 中20分钟 然后4 下12000g离心10分钟 8 弃上清 将管口敞开倒置于滤纸上使所有液体流出 加入1ml70 乙醇洗沉淀一次 4 下12000g离心5 10分钟 9 吸除上清液 将管倒置于滤纸上使液体流尽 真空干燥10分钟或室温干燥 10 将沉淀溶于20 lTE缓冲液 pH8 0 含20 g mlRNaseA 中 37 保温30min后 储于 20 冰箱中 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 五 注意事项 材料准备 使用处于对数期的新鲜菌体 老化菌体导致开环质粒增加 培养时应加入筛选压力 否则菌体易污染 质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒 如为低拷贝或大质粒 则应加大菌体用量菌株不要频繁转接 质粒丢失 五 注意事项 细胞裂解 菌体量适当 培养基去除干净 同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长 5分钟 否则质粒易被打断 复性时间也不宜过长 否则会有基因组DNA的污染 G 菌 酵母质粒的提取 应先用酶法或机械法处理 以破壁 五 注意事项 核酸分离 纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时 应提供相应的缓冲体系采用有机 酚 氯仿 抽提时应充分混匀 但动作要轻柔离心分离两相时 应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点 在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 五 注意事项 核酸沉淀 溶解 当沉淀时间有限时 用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 沉淀会更充分沉淀时加入1 10体积的NaAc pH5 2 3M 有利于充分沉淀沉淀后应用70 的乙醇洗涤 以除去盐离子等晾干DNA 让乙醇充分挥发 不要过分干燥 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2 或Mn2 离子 抑制DNasepH值为8 0 可防止DNA发生酸解 菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当 请涂布平板培养后 重新挑选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的用量不要频繁转接 每次接种时应接种单菌落 检查抗生素使用浓度是否正确 溶液 在温度较低时可能出现浑浊 置于37 保温片刻直至溶解为清亮的溶液 六 质粒DNA提取常见问题 问题一 未提出质粒或质粒得率较低 如何解决 原因 对策 混有蛋白混有RNA混有基因组DNA 不要使用过多菌体 重新纯化DNA 去除蛋白 多糖 多酚等杂质加入RNaseA室温放置一段时间加入溶液II和III后防止剧烈振荡 可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中 细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解 培养时间不要超过16小时 六 质粒DNA提取常见问题 问题二 质粒纯度不高 如何解决 原因 对策 1 简要叙述溶液 溶液 和溶液 的作用 以及实验中分别加入上述溶液后 反应体系出现的现象及其成因 2 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么 七 问题与讨论 第二部分质粒DNA含量测定10uL质粒DNA 蒸馏水至3mL混匀后 测定260nm和280nm的光吸收值 纯的DNAA260与A280之比应在1 80DNA g ml A260 稀释倍数 50 第三部分PCR根据GeneBank 用软件Premier5 0设计引物 引物序列如下 上游引物 GAATTCCAACCACTAAGTCCTGATTTC Tm 55 下游引物 ACGCGTGATAGAACTCACAACACCATC Tm 55 上游引物带有EcoR 酶切位点 下游引物带有Mlu 酶切位点 PCR反应体系 重组单菌落一牙签 1ulH2O10 buffer2uldNTP0 4ul上游引物0 8ul下游引物0 8ulTaq酶0 3ulH2O14 7ul PCR条件如下 95 5min94 30s57 30s30个循环72 90s72 10min进行1 0 Agarose电泳 检测扩增结果 第四部分琼脂糖凝胶电泳 相关知识 电泳 泳动速度决定于 琼脂糖凝胶天然琼脂 Agar 是一种多聚糖 主要由琼脂糖 Agarose 约占80 及琼脂胶 Agaropectin 组成 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质 不带电荷 而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖 由于这些基团带有电荷 在电场作用下能产生较强的电渗现象 加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果 琼脂糖透明无紫外吸收 因此 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为 共价闭环超螺旋DNA cccDNA 直线DNA LDNA 2条链发生断裂 开环的双链环状DNA ocDNA 1条链发生断裂 影响迁移率的因素 DNA分子的大小 琼脂糖凝胶的浓度 DNA的构象 所加电压一般5V cm 电场方向 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成 常用染料 EB 溴化乙锭 3 8 二氨基 5 乙基 6 苯基菲啶溴盐EthidiumBromide EB EB能插入DNA分子碱基对之间 导致EB与DNA结合 DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB 或者结合的EB本身在300和360吸收的射线 均可在可见光区以590波长发射出来 呈橙红色 EB染料优点 染色操作简便 快速 室温下15 20min 不会使核酸断裂 灵敏度高 10ng或更少的DNA即可检出 可以加到样品中可胶中 EB是诱变剂 使用时一定要戴手套 EB废液要经过处理才能丢弃 SYBR 新型低毒 高灵敏度染料 加入样品中 价格较昂贵 一 实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 二 实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 核酸为两性分子 在PH3 5时 整个分子带正电 PH8左右时 碱基几乎不解离 整个分子带负电 在碱性环境下 相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷 能以同样的速度向正极方向移动 具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样 可进行分离 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系 可以近似用于估算分子的大小 可以分离相对分子质量相同 但构型不同的DNA分子 共价闭环超螺旋DNA cccDNA 直线DNA LDNA 2条链发生断裂 开环的双链环状DNA ocDNA 1条链发生断裂 A制胶 100mlTAE缓冲液 1 0g琼脂糖