蝴蝶兰的特性及发展毕业论文.doc

蝴蝶兰的特性及发展毕业论文1 前言蝴蝶兰花姿婀娜，花色高雅繁多，花形似蝴蝶而得名，在世界各国广为栽培。蝴蝶兰花色鲜艳夺日，既有纯白、鹅黄、绊红，也有淡紫、橙赤和蔚蓝。有不少品种兼备双色或三色，有的好像绣上图案的条纹，有的又有如喷了均匀的彩点，每枝开花七八朵，多的十二三朵，可连续观赏六七十天。蝴蝶兰是热带兰花中的一个大族，靠吸收空气中的养分而生存，归入气生兰范畴，适合做室内盆景。国外多作切花，是洋兰中的高档品。蝴蝶兰是一种高雅的花卉，摆放在家庭、公司、酒店，显现生机及高贵，可作为高级礼品馈赠之用。能提供新鲜的空气并有助于缓解疲劳、休息眼睛的作用。2 蝴蝶兰的特性及发展历史2.1 蝴蝶兰的特性蝴蝶兰是一种观赏价值很高的洋兰，素有“洋兰皇后”之称。其株型非常奇特，为单茎性气生兰，根喜欢裸露在植料之上或伸出盆底，从空气中吸取水分和养分。花梗从叶腋抽出，呈弧线弯曲，极具曲线美。梗上有节，花开在上部的节上，一朵接一朵逐次开放。花色变化万千，有绯红、纯白、淡紫、鹅黄和蔚蓝色等，有些品种花色为双色或三色，并具有条纹或彩斑，缤纷艳丽。每梗可开712朵花，最多的可达70朵。蝴蝶兰植株上极少发育侧枝,比其他种类的兰花更难于进行常规无性繁殖,无法大量生产。无菌播种和组织培养是其快速繁殖的主要手段。蝴蝶兰是目前世界上最受喜爱的热带兰之一，于1980年取代卡特兰成为销售量最大的兰花。蝴蝶兰原种约40多种，分布于热带亚洲至澳大利亚和中国。迄今已发现七十多个原生种的蝴蝶兰，杂交品种有19000多个，其中以开黄花的较为名贵。有个称为“天皇”的黄花品种，堪称为“超级巨星”，价格甚昂。至于蓝花品种亦较为珍稀。如今，欧美各国人士对蝴蝶兰的消费量不断增加，举凡高级宴会都少不了蝴蝶兰作摆设。2.2蝴蝶兰历史 维多利亚时代（1830-1900）：主要作为珍贵的室内盆栽植物，极为罕有而珍贵，人工繁殖困难，多是从原产地采集 1900-1960：生产切花为主，随着运输能力的发展和种子繁殖技术的进步，蝴蝶兰越来越普及。 1960-至今：盆栽又再度流行，克隆技术的发展使得优秀的个体可以大量生产；其生产方式开始采用分工方式进行，如在美国育种，在日本组培，在中国（特别是台湾）生产种苗，然后到荷兰温室栽培成花，最后又销售到美国，国内的生产也是如此，种苗的组培克隆、小苗的栽培、中苗的栽培、高山催花到平地温室开花商品株栽培各环节都有不同的专业公司承担，大大提高了生产水平。 1952年与1953年的国际洋兰博览会上，台湾送展的蝴蝶兰连续两年获得金牌奖杯。 1989年香港举办的第14次兰花展览，胡炳炽先生送展的一棵白瓣红唇的蝴蝶兰获得全场的总冠军奖。这些杰出的殊荣为蝴蝶兰的开拓奠定了坚实的2.3 蝴蝶兰的现状及发展蝴蝶兰的组织培养最早报道于1949年,当时Rotor成功地在试管中培育出了花梗苗。近十年来,国内外许多学者对蝴蝶兰的组织培养做了大量的研究工作,建立了比较成功的工厂化育苗快繁技术,积累了较多的方法和经验。目前已经发展出以茎尖、侧芽、茎段、叶片、花梗侧芽、花梗节间、根尖为外植体的微繁体系，许多兰园有瓶苗出售。在我国洋兰的商品化生产中，蝴蝶兰可谓是最成功的典型范例，节日和年宵花市场总少不了它的倩影。蝴蝶兰品种不断更新、丰富，也是反映蝴蝶兰总体水平提升的一个重要标志。天津超群、上海交大、北林科技、青岛金卉兰业等众多蝴蝶兰生产企业都展出了自己的新品种，有的已经形成批量生产，有的正在进行组培繁育，有的是专为国内市场培育的，也有不少新品种是完全面向国际市场的。蝴蝶兰品种的极大丰富，说明我国蝴蝶兰产业正逐步走向成熟。具体来说，我国蝴蝶兰生产呈现三大特点：1.种苗出口越来越大。很多蝴蝶兰生产企业已经把目光瞄准了国际市场，尤其是针对欧洲市场推出了大量的大花形、浅色系品种。与此同时，像广州今日集团、天津超群、北京三益集团等公司每年都有稳定的种苗出口订单，而且出口数量还在逐年增加。有的公司出口订单已经排到了2008年。2.大企业越做越大，小企业越做越专。随着我国蝴蝶兰产业链的逐步形成，作为有实力的大企业会越做越大，形成集科研、育种、生产、贸易等一体化的大型蝴蝶兰专业公司。而资金并不雄厚的小企业，要全面发展显然不具备优势，因此，会有越来越多的小企业加入到专业领域的生产行列中，将产业链中的某个环节做专做细。如有的企业只培育组培苗，有的企业只生产1.5寸小苗，有的企业专做2.5寸中苗的生产，有的企业仅生产3.5寸大苗，有的企业专门负责成品花的催花，有的企业则瞄准蝴蝶兰资材产品，专业生产各种规格的育苗容器、基质肥料、盆器等。这种产业细分的趋势将随着我国蝴蝶兰产业的发展越来越明显。3.我国将成为全球蝴蝶兰种苗生产中心。从这些年我国蝴蝶兰种苗出口持续增长的形势看，国外对蝴蝶兰种苗的需求日益增加，同时，由于我国在土地、劳动力等方面的优势，生产的蝴蝶兰种苗越来越受到世界各国花卉种植者的青睐。国际市场对种苗的需求也呈现多样化，从瓶苗到1.5寸的小苗、2.5寸的中苗，以至于3.5寸的大苗，都有订单。不少业内人士预测，在未来3年内，我国将成为全球蝴蝶兰种苗生产中心。3. 蝴蝶兰生长对环境的要求3.1蝴蝶兰生长对环境的要求 喜高气温、高湿度、通风半阴环境，忌水涝气闷。越冬温度不低于15度。由于蝴蝶兰出生于热带雨林地区，本性喜暖畏寒。生长适温为1830，冬季15C以下就会停止生长，低于10容易死亡。家庭小量种植，在遇冷时应立即移入室内保持温度便可以安全过冬。 1栽培材质：由于其气生属性，其盆栽的植料不宜用泥土，而要采用水苔、浮石、桫椤屑、木炭碎等，或者直接把幼苗固定在渺楞板（又称蛇木）上，让它自行附着生长。这种栽培方法乃系仿照它在原始时的生态环境。当它开花时把整块板子挂在墙上观赏，确实别有一番韵味。蝴蝶兰的气根颇多，其根尖翠绿，相当敏感，要细心加以保护，切不可触动损伤根尖，否则此根会停止生长。 2温度选择：蝴蝶兰属热带高温兰，适宜生长温度为2030。低于15度即进入休眠，低于10容易死亡。但高于35高温影响生长并容易患病。开花需经历一个月的1518低温才能促成花芽分化，此后如果继续持续低温则花梗萌发迟缓。 3.水分选择：由于没有匍匐茎和假鳞茎，蝴蝶兰不耐旱，又由于气生性质 蝴蝶兰也畏涝湿。夏季高温时期保持材质湿润即可，可用喷雾洒水降温增湿（但不能使叶心留水容易烂心）也可在花盆旁用湿润的毛巾增湿，但一定注意：根不能长时间过分阴湿，特别是被液态水长时间包围极易腐烂，如夏日每日浇水量以当日能自然风干为好，间干间湿，这样会大大减少腐根和病害的发生率。冬季少浇水仅保持材质微湿即可。3.2蝴蝶兰的一般病虫害防护蝶兰病害的发生大多因为环境及卫生不佳导致，尤其是在低温或日照不足时特别容易产生病害，定时的环境清扫及温湿控制、病株快速移除可防止大部份的病害发生及传播。蝴蝶兰的病害一般可分为细菌、霉菌、昆虫、环境产生，发病情形及防治方法如下： 细菌性病害：此类病害一开始多于内部组织繁殖，而后漫延于叶面及株体表面上，常见症状有分泌汁液及腐烂，多因浇水过量或经由昆虫或植株间的接触传染。黑腐病症状：为兰株常见的疾病，蝴蝶兰获病通常全株溃烂而死，是相当严重的病害。防治方法：需特别注意温室通风，也需适当调降温度。若有兰株发生此并需避免喷洒水份，避免病情延漫。应以杀菌粉喷洒预防未获病兰株，并仅快将病株移除。 褐腐病症状：可说是兰病中相当难处理的的一种病害，初期于株体或叶面产生淡色斑点，随后渐渐变浓转成深褐色，并让株体产生皱折。褐腐病发病延伸相当快，从初步发病至皱摺产生发生腐烂只需一日时间，通常早上染病晚间即开始腐烂，是相当麻烦的蝴蝶兰病害。褐腐病大多发生在空气湿度高的环境，由以春夏时节最易发病，此时是空气湿度较高，兰株生长较快的时间，一旦兰株得病易使周围兰花一同获病。防治方法：褐腐病易发生于空气湿度高的环境，若是有兰株发现病状需停止浇水，并且将发病部份剪除，并施以杀菌药物，若是病情严重或有病况扩大疑虑可将病株移除或隔离。若其它兰株有染病风险可以杀菌粉喷洒预防，春夏时湿度亦要严格控制，并且保持兰园通风及环境清洁。 霉菌：环境湿度变化太大或是土壤及养液肥肥力因素引起植株受损，发生霉菌攻击兰猪组织。降低灌溉水EC值、减少介质水分是常见的治疗方法。另外兰花花瓣上的灰霉病也属霉菌病变，会在兰花朵上形小斑点，这种病变的原因在于过于潮湿或是相对湿度太高，需进行温湿度控管。 斑点病症状：大多发病于的叶上，初期叶面会产生圆形黑褐色斑点，斑点逐渐扩散最后导致兰株腐烂，属于菌病一种，多发生于秋冬低温潮湿且通风不良之环境。防治方法：这种病变多发生在低温潮湿且通风不良之环境，防治方法首重改善潮湿并保持叶面干燥，在寒冷天候仅量少浇水，并且提高环境温度并保持通风，物使潮湿水份滞流于株体上。叶枯病症状：叶枯病在初期会于叶尖开始变色，随后逐渐漫延至全叶及全株，最后整株兰花呈深褐色，受害兰株株体硬死。这种病变亦因环境过于潮湿导致，需注意湿度控制。 防治方法：注意兰园的湿度控制，改善通风也是需要特别注意处。若有发病疑虑可喷洒杀菌粉预防，已获病兰花需尽快切除隔离避免灾情扩大。 昆虫蛞蝓与蜗牛蛞蝓跟蜗牛是常见的蝴蝶兰害虫，常发生的病害情形是幼株体被啃咬产生小洞，影响兰花外观及生长。蜗牛与蛞蝓的病害相当快速，短期间就可造成很多兰株受害，一旦发现需尽快处使用除虫药剂驱除。蹒类红蜘蛛蹒类会在叶部叮咬产生变形与变色，造成兰花外观及生长不利因素。可以杀虫剂控制这类病虫。 环境引起的生理异常 花苞掉落在兰花开花完后，若是光线过强室温温度太高，容易发生花期未结束即脱落现像。若是兰花根部发展不良也有可能造成。蝴蝶兰花苞掉落需从以上两点着手处理。斑点兰花产生斑点不一定是病菌问题，有时光线过强或是环境适应不良也会产生相同症状，需注意环境之变化，尤其是株体迁移时亦需特别注意。4 蝴蝶兰繁殖技术4.1蝴蝶兰繁殖的分类4.1.1 播种繁殖法 有一种自然播种法，就是将已开裂蒴果散发出来的种子播于亲本植株的花盆中，这种方法简单易行，无需复杂的无菌程序和操作工具，适用于一般家庭蝴蝶兰种植者，但此法成功的机会甚微，极少应用。还有一种是无菌播种法，这种方法是先将未裂开的成熟蒴果洗净，然后置于7590乙醇或氯仿中浸23秒，再用510的漂白粉溶液或3的双氧水浸520分钟。取出种子在同样的消毒水中浸泡520分钟，然后用过滤的方法除去溶液，取出种子，再用细针将种子均匀地平铺于已制备好的瓶中培养基表面。培养条件为光照强度20003000勒克斯，每天1018小时，温度保持在2026。910个月后，小苗长出23片叶子便可出瓶上盆栽植。4.1.2 花梗催芽繁殖法方法是先将花梗中已开完花的部分剪去，然后用刀片或利刃仔细地将花梗上部第一至第三节节间的苞片切除，露出节间中的芽点；用棉签将催芽剂或吲哚丁酸等激素均匀地涂抹在裸露的节间节点上；处理后将兰株置于半阴处，温度保持在2528，23周后可见芽体长出叶片，3个月后长成具有34片叶并带有气生根的蝴蝶兰小苗；切下小苗上盆，便可成为一棵新的兰株。4.1.3 断心催芽繁殖兰株因一些因素而致使其生长点遭到破坏后，经过一段时间，会从兰株近基部的茎节上长出12个新芽。可以利用这一特点来繁殖蝴蝶兰。 4.1.4 切茎繁殖法切茎繁殖法的原理是破坏茎尖生长点，以诱发潜伏芽生长。蝴蝶兰植株的叶腋处虽有潜伏芽13个，但多不能萌芽成株。可待植株不断向上生长、茎节较长后，再将植株带有根的上部用消毒过的利刃或剪刀切断，植入新盆使其继续生长，下部留有根茎的部分给予适当的水分管理，不久就可萌生新芽。 4.1.5 组织培养法采用组织培养法来繁殖蝴蝶兰，可以获得与母株完全相同的优良的遗传特性。通过这种方法产生的蝴蝶兰苗通过称为分生苗或组织苗。用于进行分生培养的植物组织（外植体）可以是顶芽（茎尖）、茎段（休眠芽），也可以是幼嫩的叶片或根尖，但目前最常见的是采用蝴蝶兰的花梗。5 蝴蝶兰组织培养快速繁殖技术5.1 花梗腋芽和顶芽组织培养快速繁殖技术蝴蝶兰为总状花序，通常由花梗基部算起在第4或至第7节才会分化花朵。除最基部一节外，剥开位于该节位以上各节的苞片都可看到腋芽，近顶端的节含有未完全分化的花原始体，花轴基部的芽往往为休眠芽，常具有苞片覆盖，连同花序的顶端，都是花梗腋芽组织培养的好材料。5.1.1花梗腋芽的培养途径对花梗腋芽有两条培养途径：一是切取带腋芽的花梗茎段培养；二是不带花梗组织剥取茎尖生长点培养。其中采用腋芽茎段培养，促使休眠芽启动向营养芽转化，尔后采用丛生芽方式直接增殖，从而不通过脱分化形成原球茎阶段，可以减少变异，保持母株优良特性，但增殖速度相对后者较慢。花梗腋芽培养程序如图1所示。不定芽 增殖长根完整植株 出瓶 花梗腋芽或顶芽 诱导营养芽 茎尖 原球茎诱 增殖 完整小苗根茎 嫩叶片 剥离茎尖诱导原球茎 增殖 完整小苗图1 花梗腋芽培养程序5.1.2外植体取材、消毒和接种5.1.2.1 从蝴蝶兰出现花梗到花朵凋谢，在花梗尚未枯黄前，都可用来作为外植体。剪下来的花梗，用75%乙醇的棉化球将花梗外表的灰尘、杂物等擦拭干净，然后以节为单位切成段，含芽的花梗时上下留不同长度，置于超净工作台上，准备消毒。5.1.2.2 将花梗腋芽上的的苞叶去除，并用解剖刀把节与芽相接处清除干净。另外，若在花梗表面有病斑或焦枯的部分，应以解剖刀削去。5.1.2.3 将处理的花梗放入消毒水中消毒，消毒时间依材料、质地、嫩度的不同而异。一般花朵盛开或已凋谢的成熟花梗，在0.1%HgCl2-吐温80溶液中消毒1015分；如果是较嫩的组织，消毒时间缩短为810分钟。消毒期间，最好经常摇动瓶子，使消毒剂充分接触外植体，提高消毒效果。5.1.2.4 消毒时间到时，将材料取出，置于盛有无菌水的烧杯中，用无菌水荡洗35次。5.1.2.5 将冲洗后的外植体置于无菌的培养皿中，用锐利的解剖刀截去两端与消毒液接触部分，取出中间部分插入诱导培养基中。5.1.2.6 花梗腋芽的另一种培养方法，既不带花梗组织的采芽培养，消毒程序同上，无菌水冲洗3遍。用手握住腋芽节下端操作，用镊子剥去苞叶，露出腋芽后，用解剖刀切割，将腋芽自节上切下，取出的腋芽用0.05% HgCl2-吐温80溶液第2次消毒5分钟。用无菌水冲洗。用解剖刀片挤压生长点。接种于培养基上，切口避免接触空气。生长点成活后，24周内生长肥大，诱导形成原球茎。在固体培养基上培养12个月后原球茎上端长出叶片，下端增殖原球茎。5.1.3 操作要点5.1.3.1 消毒时间外植体的消毒过程是影响花梗培养成功与否的首要因素。消毒时间短，会导致消毒时间不完全；时间太长有会伤害外植体。因此要掌握适当的消毒时间，消毒时间的控制不是一成不变的，还要考虑到材料本身，因此只有多实践，在实践中求取经验。一旦萌芽长出，不论是长芽、抽梗，均可加以利用来继代增殖培养，繁殖原球茎或诱导丛生芽，达到扩大繁殖的目的。5.1.3.2接种植床时操作要迅速，切口不可接触空气，以免外植体被氧化产生褐变。5.1.3.3 每隔12周移植到新鲜培养基上。5.1.4蝴蝶兰花梗丛生芽或原球茎诱导培养花梗初次接种于诱导培养基上，基本培养基有Kyoto、KC、MS、3/4MS、1/3MS等，似乎不同种类的培养基均可获得成功，只不过诱导率有高低之别。附加不同浓度的BA、NAA、胰蛋白胨或椰乳能提高诱导率。实验中采用诱导培养基为1/3MS+NAA0.51.0毫克/升+6-BA3.05.0毫克/升+椰乳15%+蔗糖30克/升+琼脂6克/升，或KC+NAA1.0毫克/升+6-BA5.0毫克/升+椰乳15%+蔗糖20克/升+琼脂6克/升，另外添加柠檬酸300毫克/升防止褐变，调节PH至5.6，通常可以获得满意效果。诱导蝴蝶兰侧芽萌动的影响因素，主要集中在培养温度，腋芽节位和激素浓度等方面。蝴蝶兰花梗诱导培养操作时，每瓶接种一个外植体，置培养室培养。培养室温度为251，光照强度1500勒，每天光照1016个小时。通常花梗侧芽在适当培养基上培养710天后，腋芽突出肥大，经过15天后，腋芽萌发，可达1厘米以上不定芽。但是花梗侧芽在离体培养条件下有两种发育可能，一种是进行营养生长，长出叶片而成幼小植株；另一种是长出花梗。较高的培养温度能够促进培养腋芽朝营养芽方向分化，而较低的温度则促进花梗腋芽朝花芽方向分化；细胞分裂素BA有利于营养芽萌发，在28培养条件下，诱导率随BA浓度升高而提高，其中添加5毫克/升BA，花梗各部位的腋芽绝大多数发育为营养芽。此外，生长素的存在对腋芽诱导也有显著促进作用。蝴蝶兰花梗腋芽诱导丛生芽的较好培养条件是在2528进行光照培养，光照度为1500勒左右，培养基中添加13毫克/升BA和1.0毫克/升的NAA。按此方法，一般接种7天后，外植体萌动、膨大并向外伸长，30天后长出小叶，50天左右可长出45片叶。而花序顶端小芽的启动较慢，4050天后才见小叶萌发伸展。在培养过程中，外植体基部容易变褐色，因而要及时在原培养基上转移或转接到新鲜培养基上。这个培养程序的目的是使休眠的花梗腋芽和顶芽启动，形成营养芽，在试管内长成无菌植株，便于进一步利用，如取无菌试管苗的叶片、茎尖或根尖进行培养，建立无性繁殖体系。5.1.5继代培养将诱导产生的芽或芽丛从花梗上切离，转入继代增殖培养基上培养，一般每瓶接种610株无根苗。培养条件与诱导相同，也可以将激素浓度和配比稍做调整，主要取决于不同品种而已。一般可以适当调高细胞分裂素的浓度，降低或不用生长素，如仅添加6BA35毫克/升。影响蝴蝶兰丛生芽继代培养效果的条件和因素很多，主要是生长调节剂种类和浓度、有机物添加种类等。细胞分裂素有利于芽的增殖，在BA浓度120毫克/升范围内增殖率随BA浓度上升而增加，但是BA浓度过高会使芽的生长减弱，如BA浓度为20毫克/升时虽然增殖率最高，但芽长势细弱，呈嫩绿色（表1）。另外，培养基中添加椰乳能明显提高蝴蝶兰丛生芽的增殖率，且长势较好，而其他有机物如水解乳蛋白（LH）、水解酪蛋白（CH）和酵母汁（YE）等有机添加物不能促进丛生芽增殖，反而有轻微抑制作用。 表1 不同BA浓度对丛生芽增殖率的影响（刘荣维，1993）培养时间30天40天50天处理增殖/原芽增殖率(%)增殖/原芽增殖率(%)增殖/原芽增殖率(%)BA1.0毫克/升84/6014098/60163113/60189BA5.0毫克/升111/60186138/60230184/60307BA10.0毫克/升152/60254206/60343285/60475BA20.0毫克/升180/60300248/60414314/60523丛生芽增殖方式有两种：一种是将小芽切离花梗茎段，并横切为上下两段，分别接种培养，诱导丛生芽增殖；另一种是将芽切离茎段，作为种苗接种培养，30天左右在基部可萌发新的芽丛，40天后可分割丛生芽，按照苗的大小分级移植，由此通过不断分苗，不断获得种苗和丛生苗，达到扩大繁殖的目的。丛生芽增殖周期较长，需要添加椰乳、水解胰蛋白等适宜的有机物。5.1.6壮苗和生根培养通过丛生芽增殖途径繁育的小苗在原培养基上，植株生长缓慢、细弱，不宜诱导生根成苗，因此，需要转移到新的培养基中促进生长和生根。蝴蝶兰壮苗与生根一般同时进行，其基本培养基成分与继代所需相同，主要是对激素浓度和配比作些调整。试验证明，同时降低BA和NAA浓度，可明显促进植株生长，但浓度过低又不利于生长，最佳浓度为BA1.0毫克/升、NAA0.1毫克/升，此时植株生长健壮，叶数可达34片，根长且粗壮。在促进根系生长方面，适当提高光照浓度可明显促进植株生长健壮，其中以3000勒光强最好，表现出叶色浓绿、叶片肥厚、植株健壮；而在1000勒时，叶色浅绿、叶片瘦长、植株较弱。在培养基中添加香蕉泥和马铃薯泥，可以明显促进根系生长，生根数量较多。5.1.7 试管苗移栽和养护从瓶中取出试管苗，洗净根部琼脂，消毒后移植于温室塑料筛筐中培养。培育基质以水苔为主，另加少量陶粒、蛭石，碎砖和树皮等颗粒硬材料。由于水苔保湿性能好，有利于蝴蝶兰幼苗气生根的生长，植株生长健壮，叶片大而宽，色泽亮绿。2周后可使用花宝1号等优质花肥叶面喷施和灌根。幼苗生长很快，有当年开花的报道，多数在12年内开花。荷兰安烛花栽培模式，蝴蝶兰16个月开花；中国台湾栽培模式，蝴蝶兰1720个月开花。5.2 茎尖组织培养快繁技术茎尖是细胞分裂最旺盛的部位，是较易诱导、培养成功率较高的部位。茎尖培养一般要通过原球茎阶段达到快速繁殖目的，因而增殖系数一般比丛生芽增殖型的速度快。5.2.1茎尖获取与消毒接种5.2.1.1盆栽兰苗茎尖获取：由于蝴蝶兰的茎尖深藏于叶片夹缝中，分离和消毒很困难,因而直接从盆栽兰苗采取外植体进行培养的难度相对较高，成功率低，但这是为获得保留母株优良性状的组培苗时必需的。成株蝴蝶兰从茎中部切断，剥除叶片。用水冲洗，最后去掉顶部嫩叶。在浓洗衣粉液中，用毛刷仔细刷洗茎顶部叶片夹缝处，用自来水冲洗20分钟。用刀修整茎尖后浸染入0.1%HgCl2-吐温80 溶液消毒5分钟,无菌水冲洗3次。超净工作台上，于解剖显微镜下剥离不大于5立方毫米的茎尖，再次浸入含有效氯0.5%84消毒液中灭菌510分钟,无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干水分, 茎尖接种到诱导培养基上。5.2.1.2 试管苗茎尖培养：蝴蝶兰茎尖培养常用的外植体是利用花梗腋芽萌发或种子发芽的无菌实生苗，切取其茎尖进行培养，诱导原球茎，其目的是通过原球茎方式能够快速的繁殖试管苗。这种取茎尖培养的方法免去了茎尖外植体消毒程序，成功的几率较高。取茎尖的方法相似，一般需借助解剖镜，在无菌条件下，用手术刀切去试管苗的根、叶，小心剥取0.31.0毫米大小的茎尖，接种于诱导发生原球茎的培养基上。5.2.2茎尖诱导原球茎初代培养原球茎诱导成功与否受诸多因素影响，最主要的是培养基的种类、生长调节剂种类及浓度配比。诱导培养基通常采用MS、VW和KC附加15%椰乳的固体培养基，添加BA5.0毫克/升或2，4-D0.1毫克/升。附加活性炭0.25%常可提高诱导率。 在实际生产操作中，茎尖诱导培养基常需要依据不同品种而作调整，因为基本培养基、激素浓度及配比对不同的蝴蝶兰品种而言有所差异。如古川仁朗等将茎尖接种在添加椰乳的VW培养基基上，液态、固态交替培养1个月，即可获得原球茎体；而曾宋君等（2000）报MS培养基的效果最佳，6-BA浓度以5.0毫克/升时较好，低浓度（0.5毫克/升）的2，4-D明显地能促进原球茎的形成，NAA对茎尖原球茎的诱导无明显促进作用。海南蝴蝶兰在KC培养基诱导的效果比较好，但不使用外源激素不能诱导茎尖产生原球茎；单独使用生长素NAA也不能产生原球茎；单独使用0.52.0毫克/升范围内的BA可诱导茎尖产生原球茎，但诱导率低；BA浓度达到5.0毫克/升或以上时，20天后茎尖开始褐化坏死，这可能是高浓度BA刺激多酚氧化酶活性提高，对培养物产生毒害作用。NAA与BA配合使用诱导效果较好，以BA2.0毫克/升+NAA0.5毫克/升和BA4.0毫克/升+NAA0.5毫克/升配比最好，原球茎诱导率高。茎尖接种到诱导培养基上，25恒温培养，15002000勒光照强度每天光照1624小时。2周后外植体膨大，少数较大的茎尖切块长出侧芽继而形成小叶片，随后在叶片上长出颗粒状的原球茎，另一部分体积较小的茎尖膨大后直接从周围长出原球茎。可见大小适中的茎尖诱导形成的原球茎的速度较快。3个月后，长成桑果状原球茎状体，组织块直径约6毫米，类似于愈伤组织，只是表面上布满了圆球状颗粒。这些颗粒可以用镊子剥离，用于继代培养。5.2.3.继代增殖及生根壮苗培养参照原球茎继代增殖和生根壮苗的部分。5.3 叶片组织培养快速繁殖技术取叶片培养对蝴蝶兰母株伤害不大，也不受植株开花与否的限制，是较适合的培养途径。与茎尖培养一样，蝴蝶兰的叶片培养也是通过诱导原球茎增殖方式实现快速繁殖的。自然生长的兰株要用10%的次氯酸钠溶液进行常规灭菌，再切成1厘米1厘米的小块接种培养，但诱导率很低，实际工作中使用不多。由花梗芽或由原球茎分化形成的叶片，或试管实生幼苗叶片不要经过表面消毒，诱导率很高，实际工作中多采用。5.3.1外植体的准备、接种兰株采用试管苗，最好以液体培养使叶片肥厚，然后切取叶片基部0.51.0厘米培养。将切取的部位上表面朝上平放于培养基上，初期的一个月左右采用暗培养效果较好。诱导形成愈伤组织状的原球茎状体，在固体培养基中增殖，或在液体培养基中增殖。5.3.2诱导培养有关蝴蝶兰叶片组织培养，日本田中道男等（1979）研究较早，有比较系统全面的报道。我国也有许多学者进行了研究，但从文献报道中来看，各种培养基皆能成功，但诱导叶片产生原球茎的诱导率都不理想，一般低于20%。影响叶片外植体诱导成功率的因素主要有叶片取材部位、培养基成分、激素种类和浓度、有机添加物和活性炭等。5.3.2.1 培养基：常用的培养基有MS、Kyoto (狩野氏)、改良KC、G3等，其中最常用的是MS培养基。虽然一些试验表明这些基本培养基的培养效果有一定的差异，但不是决定因素，主要表现出诱导率高低不同，而不是能不能成功。实验结果显示：Kyoto+KT10毫克/升+NAA5毫克/升+苹果汁或椰乳100毫克/升；Kyoto+BA5.0毫克/升；KC+BA5.0毫克/升；MS+BA3.0毫克/升；MS+BA5.0毫克/升+NAA1.0毫克/升培养基，均能诱导出原球茎，只是诱导率有所不同，以MS培养基诱导率最高。5.3.2.2 激素种类和浓度：这是叶片原球茎诱导的关键影响因素，其中细胞分裂素BA是决定蝴蝶兰原球茎能否产生的重要因素。杨美纯等研究发现在所有未添加BA的培养基上，不管添加何种果汁，均未能诱导出原球茎，而只有在添加了BA的培养基上才能形成原球茎，其中以MS附加5毫克/升BA的组合能获得较高的原球茎诱导率，又能使原球茎进一步生长发育正常。同时还发现，加入果汁能明显提高原球茎诱导率，以在MS+BA5.0毫克/升培养基中加入椰乳的诱导率最高，达到42%43%，而不加果汁的诱导率仅18%，而且每个外植体叶块上产生的原球茎颗粒既多又健壮。5.3.2.3 培养条件：对原球茎诱导效果也有显著影响，其中较高温度、较低光照强度有利于提高诱导率，完全光照或高于光照强度1000勒不利于原球茎诱导。25培养叶片、500勒光照培养有利于原球茎的形成。5.3.2.4 快繁无性系建立：外植体叶块接入诱导培养基30天，即可发现部分切块叶片边缘有少量直径约1毫米的黄绿色原球茎状颗粒出现；50天后，随着培养时间延长，颗粒增多，体积膨大，叶片切口处长满原球茎状体，此外有些叶片表面还长出单个或丛生状的原球茎状体，用镊子轻轻拨动即可使原球茎与外植体分离。转移至新鲜培养基上继代增殖培养，可使原球茎无限增殖，如此反复切割继代培养，快繁无性系就建立起来了。继代培养时注意切块不可过细，每瓶培养物切块应保持一定的密度，蝴蝶兰与其他兰花一样表现出一定的群体生长效应。试验中发现较大的切块上原球茎形成的芽粗壮。蝴蝶兰原球茎对细胞分裂素6-BA比较敏感，通过调整6-BA可以控制原球茎的发育方向。当6-BA浓度较