谷胱甘肽生物转化研究.doc

生物转化法合成谷胱甘肽的研究 张磊 薛钊坤 （浙江工业大学生物与环境工程学院 杭州 310014）摘要：本文以编号X23的藤黄八叠球菌为研究对象，研究其生物转化合成谷胱甘肽的可能性。通过从物理、化学和生物三方面因素改进转化条件：转化过程中以100mg/L湿菌含量加入新配制pH为7.5的转化液137、转速200r/min的摇床转化6h，用超声波对含菌的转化液破壁10min，接着于3500r/min离心机离心20min后取上清液,为最佳的物理因素；通过正交实验分析方法得转化液最佳成份浓度为葡萄糖0.75mol/L、MgCl20.01mol/L、底物浓度0.03mol/L，找到并证实微量元素浓度20mg/L的ZnSO47H2O对谷胱甘肽合成酶有激活作用，为最佳化学因素；连续生物转化进行两步可使转化产量达到88.43mg/L，一次从发酵到转化两步的生产过程可产谷胱甘肽231.27mg/L，较原菌株只发酵的产量142.75mg/L提高61.94%。关键词：谷胱甘肽、藤黄球菌、生物转化RESERCH OF BIOLOGY SYNTHESIS OF GLUTATHIONE ZHANG Lei XUE Zhao-Kun (College of Biology and Environment Engineering Zhejiang University of Technology ,Hangzhou ,310014)Abstract:Sarcina lutea strain X23,which was stored in the microbiologic lab of the Zhejiang university of technology was studied for the biological transform of glutathione.The condition of the glutathione biologic transform and component of the productive liquid through were improved through physical chemical and biologic factors. The productive liquid pH 7.5 contained Sarcina lutea 100mg cell/L,was placed in a flask and incubated at 37with shaking at 200r/min for 6h,then the strain with productive liquid was smashed for 10min by sonicate, supernatent was got by centrifugation at the speed of 3500r/min for 20min,that was the optimum physical factor. Composition of the productive liquid, Glucose 0.25mg/L、MgCl2 0.01mg/L、Amino acids 0.03mg/L. was obtained by the quadratic design. the ZnSO47H2O at the concentration of 20mg/L which was discovered and confirmed can activate the endosynthase of glutathione, that was the optimum chemical factor. The result indicated that the glutathione production reached 88.43 mg/L after two steps biologic transform process, The productivity of glutathione can be obtained 231.27 mg/L of during the whole process, which was 61.94 higher than in the synthesis. Key words: Glutathione Sarcina lutea biologic synthesis还原型谷胱甘肽（L-Glutathione，简称GSH）是由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸构成的活性三肽。自1938年发表了由酵母备制谷胱甘肽的最早专利以来3，还原型谷胱甘肽在临床上有着广泛的应用，它能够防止皮肤色素沉积、改善皮肤光泽，是治疗肝病、重金属中毒、放射性损伤、肿瘤、白内障等疾病的有效药物，最近还发现谷胱甘肽可能具有抗艾滋病毒的功效。谷胱甘肽现在已广泛运用于食品加工的各个领域，在日本谷胱甘肽被认为是21世纪最有希望的保健食品之一。谷胱甘肽作为一种重要的氨基酸类生化药物，随着人们在食品添加剂、临床医学和运动营养学上对它的兴趣日益增长，市场需求量不断增加。目前生产谷胱甘肽最普遍的方法是发酵法生产，发酵法生产谷胱甘肽基本以酵母发酵为主，国内外尚未见到以革蓝氏阳性菌产生的酶系催化合成谷胱甘肽的报道，本课题旨在弥补这一空白。由于GSH合成酶在细菌体内的活性和产量受细菌调控，因此要提高转化率一个重要途径是优化生物转化条件。本论文通过一定方法提取细菌中相应的活性酶，研究其最适转化条件和最佳配方以提高谷胱甘肽的生物转化率。由于藤黄八叠菌的生长周期仅为酵母的1/3，利用该细菌高产谷胱甘肽合成酶菌株进行转化法生产谷胱甘肽，可以大大缩短生产周期提高经济效益，促进产业化生产。1 材料与仪器1.1 菌种来源 藤黄八叠球菌（浙江工业大学生物实验室收集和保藏）1.2 培养基1.2.1 斜面培养基（完全培养基）及培养条件2：培养基：葡萄糖30g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠 5g、琼脂20g定容至1L水。pH自然，1.0105Pa 灭菌20min。1.2.2 种子培养基及培养条件：葡萄糖30g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠 5g、定容到1L， pH自然，1.0105Pa 灭菌20min。1.2.3 发酵培养及培养条件：培养基：糖蜜30g、白胨25g、七水硫酸镁 5g、 磷酸二氢镁 1g cysHCl 1.5g,加水定容1000ml pH7.0,1.0105Pa、灭菌 20min。 1.3 TL0转化液配方1转化液TL0：pH 7.0，K2HPO4-KH2PO4缓冲液，葡萄糖9g/L，MgCl2 2.05g/L，底物氨基酸0.03mol/L（谷氨酸4.4g/L，甘氨酸2.25g/L，半胱氨酸5.25g/L）。1.4 主要仪器：LS-B50L立式蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂；751-GW，分光光度计,上海分析仪器厂；高速离心机LD5-10；超声波粉碎机（CPS-IA）上海超声波仪器厂，摇床（HWY-V11）上海智城分析仪器厂。2 实验方法2.1 菌种培养及发酵方法取实验室保藏的藤黄八叠球菌种，接种于斜面培养基上活化2代后，取2-3代长势良好的菌群，无菌操作，将菌接于种子液中，30摇床转速180r/min，培养20h，将含菌种子液以10%接种量用无菌移液管移取加入新配制的发酵液中，30摇床转速180r/min，培养18h。2.2 生物转化方法将发酵后的发酵液于3500r/min离心后去除上清液，沉淀为湿菌种，加少量TLo转化液用超声波细胞捣碎机破壁10min后，按100mg/ml菌体量加入TLo转化液,于30、转速180r/min震荡转化6h。 2.3 GSH产量分析方法2.3.1 胞内谷胱甘肽含量测定：ALLOXAN试剂衍生法，见文献42.3.2 GSH样品标准曲线：利用最小二乘法可得到两者关系，C（GSH）=（812.13*A-6.03388）307.33 相关系数R=0.9983 见文献2 2.4 转化物理因素的研究 图.1 样品GSH标准曲线Fig.1 Standard line of specimen GSH对转化的温度、pH、时间、摇床转速、菌种破壁时间选择依次进行实验，以确定最佳的转化条件中物理因素。2.4.1温度发酵液按100mg/ml菌体量加入TLo转化液，用超声波破壁后，取4个三角瓶，按15ml/瓶加入三角瓶中，分别放入温度为28、30、37、50 转速均为180r/min的摇床转化6h，测转化液GHS产量。2.4.2pH新配制的TLo转化液，以15ml/瓶分装4个三角瓶，用1N NaOH 将pH调至6.5、7.0、7.5、8.0，同样按100mg/ml菌体等量加入4种不同pH转化液中，温度37摇床转速180r/min，6小时后测转化液GHS产量。2.4.3时间发酵液按100mg/ml湿菌量加入新配制的pH为7.5转化液，取250ml瓶4个，每瓶加入15ml含湿菌的TLo转化液，摇床设定37、180r/min，转化时间为3h、6h、9h、12h后各取出一瓶测转化液GHS产量。 2.4.4摇床转速按100mg/ml湿菌量加入新配制的pH为7.5转化液，取250ml的三角瓶4个，每瓶用移液管移取15ml含湿菌转化液，放入温度为37转速分别设为150r/min、180r/min、200r/min、230r/min的摇床，转化6h然后测转化液GHS产量。2.4.5菌种破壁时间选择离心除去发酵液，对湿菌进行分步同时实验如下:1、 湿菌1.5g加pH7.5 TLo转化液15ml，用超声波破壁20min，试验号记为d2、取湿菌3g加少量pH7.5TLo转化液，摇匀用超声波破壁10min，加转化液至30ml（即含湿菌100mg/ml）分入两个三角瓶，15ml/瓶，试验号记a、b3、同时取湿菌1.5g加pH7.5Tlo转化液15ml移入三角瓶试验号记为c4、a放入冰箱冷冻，b、c、d放入37 速200r/min摇床转化6h后，C用超声波破壁10min后和b、c、d同时以3500r/min离心机离心15min 测转化液GHS产量。2.5 转化化学因素的研究2.5.1转化液成分 用正交试验方法对转化液中葡萄糖、MgCl2、底物氨基酸的浓度的比例进行优化。2.5.2酶液激活剂酶激活剂一般以无机盐离子为主，本文选用生物实验中常用无机盐微量元素进行研究，欲寻找能激活胞内谷胱甘肽酶的微量元素。 表.1 微量元素的种类和浓度Table.1 Species and consistency of micro-mineral编号 12345678化合物名称H3BO3CoCl2FeCl3ZnSO4MnCl2(NH4)6Mo7O24CuSO45N2OCaCl2化合物浓度(mg/L)0.021.000.2020.00.020.140.021.11g/L在发酵进行到18h时，用离心机离心得具有最大酶活的湿菌，按100mg湿菌/ml加入新配制的转化液，分装入9个三角瓶，15ml/瓶，编号0-8，0号为对照样不加其他微量元素，1-8号按表1加入微量元素。转化后测GSN含量。2.6 转化生物因素的研究二步转化以2.4.1中菌种破壁时间选择中编号为a、c的实验三角瓶制做方法加新配制转化液转化后记编号为a1、c1 。 测a1（只发酵不转化）和c1（发酵后转化一步）的GSM产量。c1用转速3500r/min离心15min后去除第一步转化时的残菌体，上清液继续按100mg/ml 加入发酵成熟的新菌种，取3个三角瓶，15mg/瓶编号H1，H2，H3进行第二步转化，测GSN产量。3 结果与讨论：3.1 物理因素对GSH产量的影响:3.1.1 转化温度对GSH产量的影响：表.2 温度上升对GSH产量的影响Table.2 Effect of increased temperature on production of GSH表.3 pH改变对GSH产量的影响 Table.3 Effect of changed pH on production of GSH在转化过程中选择一般适合细菌生长实验室有培养箱的几个温度点如28、30、37、50进行转化试验，实验结果(见表2),GSH在温度较低时随温度升高而增加，37时产量达到最大，温度再升高，到50GSH的产量下降了。这表明，在37谷胱甘肽合成酶具有最大活性。如有机会可进行3750之间的温度试验，以寻找更精确的温度点。编号pH1pH2pH3pH4pH6.57.07.58.2A3050.6440.6890.7320.301C(mg/L)158.7169.93180.65172.92编号T1T2T3T4T()28303750A3050.7680.8070.8730.801C(mg/L)169.6199.4215.8197.93.1.2 转化液pH对GSH产量的影响:转化过程中选择菌种生长的合适的pH6.5 7.0 7.5 8.0 试验结果显示（见表3）,pH从弱酸性到中性过程,GHS产量随pH升高而增加.当pH达到7.5成弱碱性时产量最大180.65mg/L碱性继续增强到8.0时产量下降.这表明pH7.5时最合适谷胱甘肽合成酶生理活性的发挥。3.1.3 转化时间对GSH产量的影响：编号R1R2R3R4转速(r/min)150180200230A3050.5120.6080.430.647C(mg/L)125.80149.74158.46159.46表.5 摇床转速增加对GSH产量的影响Table.5 Effect of increased rotational speed on production of GSH转化过程开始后每隔3h取样一次测GSH的产量，3h、6h、9h、12h共四次。实验结果（见表4），在转化到达6h时GSH的产量达最大值166.19mg/L 继续延长转化时间产量没有明显增加，并且可以从实验数据看出长时间的摇床运行会使GSH有所氧化而导致产量的下降。编号t1t2t3t4T (h)36912A3050.5720.6740.6820.669C(mg/L)140.76166.19168.1164.9表.4 转化时间对GSH的影响Table.4 Effect of length of time on production of GSH 3.1.4 摇床转速对GSH产量的影响：由于藤黄八叠菌种是好氧菌GSH合成需要大量ATP，所以转化过程中提高摇床转速有利于产量的增加。但通氧量的增加同时加速了GSH的氧化。因此当两者达到平衡时摇床的转速是最佳的。实验转速设定为150r/min 180r/min 200r/min 230r/min 四档，结果表明（见表5），当转速达到200r/min时产量接近最大值158.46mg/L。继续提高转速到230r/min产量没有明显增加。3.1.5 细胞破壁时间选择对GSH产量的影响：实验结果表明（见表6、图2），对菌种在转化后破壁比转化前破壁产品GSH的产量要高，破壁时间10min比20min效果要好。数据显示c瓶产量181.90mg/L最高。 表.6 细胞破壁时间不同对GSH产量的影响 Table.6 Effect of different time of cellwall broken On production of GSH 图.2 GSH产量的比较 Fig.2 Comparison of production of GSH编号abcdA3050.5870.6140.7370.704C (mg/L)144.50151.23181.90173.67（注释：a 只发酵不转化时GSH的产量（对照样）, b 转化前破壁10min, c 转化后破壁10min, d 转化前破壁20min）.32化学因素对GSH产量的影响：321转化液基本成分对GSH产量的影响因为细菌生物转化合成谷胱甘肽的必需营养包括葡萄糖，谷氨酸、甘氨酸，半胱氨酸三种底物和必要的酶激活剂。以TLo转化液为基础对葡萄糖、MgCl2 底物浓度进行正交实验。表.7 实验水平和因素Table.7 Factors and level of experiment因素 1(葡萄糖)2(MgCl2)3(底物)A305C(mg/L)11110.633155.9721220.647159.4631330.512125.8042120.654161.2152230.663163.4562310.553136.0273130.721177.9183210.789194.8693320.569140.01K1 (mg/L)441.23495.09486.85K2 (mg/L)160.68517.77460.68K3 ( mg/L)512.78401.83467.16R71.55115.9426.17 因素 葡萄糖（mol/L）MgCl2 （mol/L）底物浓度 （mol/L） 10.250.0050.0320.50.010.1030.750.020.20表.8 正交实验数据Table.8 Date of orthogonal optimization正交实验结果（见表7、表8）显示：从GSH产量看最佳实际配方为8号瓶，从K值分析最佳理论配方为3、2、1组合也是8号瓶，理论与实际吻合。从R值分析表明葡萄糖和MgCl2的浓度和对转化的影响较大，底物浓度的影响较小，从实验结果确定转化液的配制为：葡萄糖0.75mol/L，MgCl2 0.01mol/L, 底物浓度0.03mol/L。有机会还可对MgCl2浓度进行微调研究，以更好的优化配方。322 微量元素对GSH产量的影响：编号012345678A3050.5860.6340.4930.5940.7660.5040.6020.6360.590C(mg/L)144.25156.22121.06146.25189.13123.81148.24156.72145.25在发酵进行到18h时，用离心机离心得具有最大酶活的湿菌，按100mg/ml加入新配制的转化液分装入9个三角瓶 15ml/瓶，编号0-8，0号为对照样不加其他微量元素，1-8号按表1加入微量元素。转化后测GSN含量。表.9 比较各种微量元素对GSH产量的影响Table.9 comparison of different micro-minerals effect on production of GSH 由此实验0到8号GSH的产量数据（见表9、图3）显示：加有微量元素Zn的4号其GSH产量为189.13mg/l最大，较不加微量元素的0号144.25mg/l高出44.88mg/l ，提高33.11%证明转化液中，如加入20mg/l ZnSO47H2O时，可提高酶活，从而提高GSH产量。 图.3 0-8号瓶GSH产量的比较Fig.3 comparison of production of GSH range from No.0-833 生物因素对GSH产量的影响： 实验通过对同一批菌种进行只发酵不转化的a1瓶测GSH的产量（对照样）c1瓶发酵一步测GSH产量。H1 H2 H3瓶发酵二步后测GSH产量， H是H1 H2 H3的平均值。 表.10 生物转化中各步GSH产量的比较 Table.10 Comparison of production of GSH on different steps编号a1c1H1H2H3c1-A1H-a1A3050.5800.7620.9320.9370.9350.1820.193C(mg/L)142.75188.13230.52231.76231.2745.3843.05 由实验得出（见表10、图4）二步转化产量平均值43.05mg/L和一步转化的产量持平，一二步转化总产量较菌种发酵后转化前提高88.43mg/l，提高率61.94%。图.4 各步GSH产量的比较Fig.4 comparison of production of GSH 4 结论 综上所述，通过一系列从探索到证明的系统的实验，证明了藤黄八叠球菌X23有生物