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非洲猪瘟实验室诊断 AfricanSwineFever ASF 2 定义 非洲猪瘟是家猪 疣猪 欧洲野猪和美洲野猪的一种传染性极强的出血性疾病 所有年龄的猪都易感 世界动物卫生组织 3 可表现为最急性 急性 亚急性和慢性四种形式严重程度与毒株 猪种及流行时间的长短有关急性型以高热 食欲废绝 皮肤发绀 网状内皮系统出血为特征 发病后2 10天内死亡 病死率可高达100 临床上 与古典猪瘟非常相似 难以区分目前没有疫苗 2017 5 15 4 只感染猪家猪和欧亚野猪非常易感 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且没有临床症状软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传播媒介法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天 2017 5 15 5 重要性OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病我国动物疫病名录一类动物疫病我国 中长期动物疫病防治规划 2012 2020年 明确重点防范的外来动物疫病 6 病原 非洲猪瘟病毒科中唯一成员 AsfarviridaeAsfivirusASFV 兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 唯一核酸为DNA的虫媒病毒 只有一个血清型 7 特点之一 基因组大 170 190kb 蓝耳病病毒15kb12倍 猪瘟病毒12kb15倍GenomeCSFV 口蹄疫病毒8kb24倍GenomeFMDV 病原 8 病原特点之二 基因多变基因组两端各有一个高变区 基因型多达22个 9 特点之三 抵抗力强 温度 60 20分钟 56 70分钟25 37 数周4 1年冻肉数年到数十年 pH 4 11 5无血清4 13 4有血清未熟肉品 腌肉 泔水中可长时间存活 病原 乙醚 氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活 10 临床症状 最急性型急性型亚急性型慢性型 2017 5 15 11 临床诊断 最急性型无临床症状 突然死亡急性型 强毒株 发烧 41 42 C 食欲减退不愿活动局部皮肤变红或变蓝色腹泻呕吐呼吸困难流产 死亡率高 10 100 仔猪发生ASF 耳 鼻 唇 腿发红 神经症状 数小时内死亡 Mityana Uganda 2010 12 临床诊断 亚急性型 中等毒力毒株 症状同急性型 但较轻死亡率低持续时间长 3周 慢性型 低毒力毒株 消瘦或发育迟缓 体弱偶见体温升高 波状热呼吸困难 湿咳怀孕母猪流产多处皮肤局部红斑 溃疡耳部 腹部 大腿内侧可能凸起或坏死易继发感染 如继发引起肺炎和关节炎感染后能康复 但终身带毒死亡率低 可见血清转阳 13 临床诊断 各种毒力的毒株均可导致流产胎儿可能全身水肿胎盘 皮肤 心肌或肝脏可能有淤血点 14 诊断病理诊断 脾脏肿大易碎暗红色至黑色 15 胃 肝 肾各部位淋巴结肿大 出血 16 水肿肺 肝 膀胱胆囊充盈结肠系膜 17 肾皮质出血点 出血斑 出血瘀点瘀斑 18 慢性型 纤维素性心包炎 并可见出血点 肺局部肉变 实变 肺部局部肉芽肿 形成结节 19 图1 ASF猪尸体底部的发绀病变 图2 耳尖的发绀病变 图3 血性腹泻 血痢 图4 急性ASF死猪肺小叶间的水肿 20 图5 胃的基底膜淤血 急性 图6 典型肿大脆化脾 黑浆果脾 急性ASF 图7 病猪脾 上 与正常脾大小的比较 急性ASF 图8 急性ASF猪肿大的褐色脾 巴西品种 21 图9 肾淤斑及出血点 急性 图10 肾盂及肾乳头部的出血斑 急性 图11 肾盂处散在的出血点 急性ASF 图12 肿大 出血的肝胃淋巴结 可出见有血凝块 急性 22 图13 肝胃淋巴结切面 肿大并呈暗红色 急性ASF 图14 心包积液及心包肌层有散在的出血点 急性ASF 图15 胆囊水肿 急性ASF 图16 肺部可见肉芽肿病变 形成一结节 慢性ASF 23 图17 肺实变区 慢性ASF 图18 心包脏层附有纤维素 而且可见出血点 慢性ASF 24 鉴别诊断 高致病性蓝耳病猪皮炎肾炎综合征 PDNS 由PCV 2引起细菌性败血症香豆素中毒真菌毒素中毒 2017 5 15 25 VirusAb 感染 表现出临床症状 携带者 病毒血症 感染后2 3天到8天 持续很长时间 数月 特异性抗体 从感染后的7 11天至数月 甚至数年排毒 从感染早期 第2天 以后持续很长时间 甚至康复后 ASF感染的主要特征 猪 野猪和家猪 软蜱 26 实验室诊断 实验室诊断 病原学 血清学 病毒分离 血细胞吸附试验 直接免疫荧光法 FAT 普通PCR和荧光定量PCR 双抗体夹心ELISA测定ASFV抗原 间接ELISA测定ASF特异性抗体 阻断ELISA检测ASF特异性抗体 唯一确诊单位 国家外来动物疫病研究中心 免疫印迹 间接免疫荧光测抗体 27 实验室诊断 血清样品 析出的血清 不合格血液样品分离好的血清单独包装 并一一编号 合格血液样品 28 实验室诊断 病原学样品抗凝血淋巴结脾脏肾脏骨髓 29 实验室诊断的安全原则 保障人员的安全穿戴 眼罩 手套 实验服 口罩和鞋套等行为 洗手 禁止聊天 实验室内禁止食用食物和饮料等了解化学试剂的特性和潜在的危险保障样品的安全防止样品交叉污染一次性手套 2017 5 15 30 良好的工作区域 第一步实验前清洁试验区域 台面 移液器等 注意消毒剂的期限第二步划分不同的区域样品处理 BSL 3提取病毒DNA PCR检测 Mix配制 加DNA 扩增等 ELISA检测区域 加血清 洗涤 终止等 2017 5 15 31 GLP goodlaboratorypractice 原则制定一整套标准以确保质量 可靠性和完整性 可核查结论和可追溯性数据的报告 要点资源 组织 人员 设施和设备特征 检测项目和测试系统规则 试验步骤 标准操作程序 SOP 结果 原始数据 最后报告和档案质量保证 独立监测的研究过程2017 5 15 32 实验室诊断技术储备 278bp 257bp 英国Pirbright实验室比对实验 建立了猪瘟 非洲猪瘟的荧光定量PCR鉴别诊断方法 双抗体夹心ELISA检测抗原 阻断ELISA检测抗体 间接ELISA检测抗体 33 间接ELISA检测病毒抗原 商品化试剂盒INGEZIMK3 Ingenasa Spain 价格比PCR便宜不需要复杂的操作适用于基层实验室敏感性低 慢性或亚急性 2017 5 15 34 分子生物学检测方法 O20u17r a5 1C5 A L Edwards andC A Batten 2013 VirologicaldiagnosisofAfricanswinefever comparativestudyofavailabletests Virusresearch173 150 158 35 荧光PCR检测病毒DNA 36 荧光PCR工作单样品的可追溯性 2017 5 15 37 荧光PCR检测病毒DNA 试剂准备 病毒DNA提取试剂盒 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒 38 荧光PCR检测病毒DNA 试剂制备 冻干蛋白酶K 将蛋白酶K溶解在4 5ml灭菌后的蒸馏水中 将溶液以500 l分装 在 10 C温度下储存 直到使用 除抑制物缓冲液 将20ml无水乙醇加入原始小瓶中混匀并进行相应的标记和日期记录 室温储存 冲洗缓冲液 将80ml无水乙醇加入原瓶中混匀并进行相应的标记和日期记录 室温储存 39 荧光PCR检测病毒DNA 仪器设备 水浴锅或金属浴匀浆仪和匀浆管 陶珠 台式离心机荧光PCR仪移液器 40 荧光PCR检测病毒DNA 样本处理 组织样本取100mg组织剪碎 加入1mlPBS研磨或匀浆 然后1050g或2000rpm离心10分钟取上清 全血 抗凝血 或血清直接吸取200 l 41 提取病毒DNA 将200 l结合缓冲液 绿盖 和40 l蛋白酶K 20mg mL 加入到1 5ml离心管中 加入200 l样本 每个提取程序都加入E 和E 200 l水 对照 立即混匀并在72 2 C温度下孵育10分钟 将1 5ml微离心管简单离心操作 除去管盖内部的水珠 将100 l异丙醇加入样本试管 混匀 将过滤管放入收集管中 并将样本移入过滤管 42 提取病毒DNA 2 将过滤管以8000g离心1分钟 如果样本依然留在过滤管中 重复离心操作 扔掉收集管 将过滤管加入干净的收集管中 将500 l除抑制物缓冲液 黑盖 放入过滤管 以8000g离心1分钟 扔掉收集管 将过滤管放入干净的收集管中 将500 l冲洗缓冲液 蓝盖 加入过滤管 以8000g进行1分钟离心操作 扔掉收集管 重复冲洗步骤 500 l冲洗缓冲液加入过滤管 以8000g进行1分钟离心操作 扔掉收集管 将过滤管放入干净的收集管中 以13 000g进行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液 扔掉收集管 将过滤管放入干净的1 5ml微离心管中 43 提取病毒DNA 3 将50 l 100 l预热的消毒蒸馏水加入过滤管 注意不要使用试剂盒中Elutionbuffer 以8000g进行1分钟离心操作 将DNA溶液在 10 C温度下储存 有效期 12个月 备用 如果DNA溶液在1 2小时内用于PCR操作 在4 3 C温度下短暂储存 然后冻存 44 荧光PCR检测病毒DNA OIE方法 配制反应体系 反应液溶解后 每个反应管中加入18 l反应液 然后再加入2 l模板 每次试验需设立反应阳性对照 R 绿管中的反应阳性对照 和反应阴性对照 R 灭菌水 45 46 荧光PCR检测 程序设置 47 荧光PCR检测病毒DNA 实验结果 48 荧光PCR检测病毒DNA 结果判定 有效性 提取阳性对照 E 和反应阳性对照R 的Ct值应小于35 且提取阴性对照 E 和反应阴性对照 R 无Ct值 则试验有效 阳性和阴性 当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct值小于37时可判定为阳性 当样品的扩增结果在背景信号之下或Ct值 37时 判定为阴性结果 可疑样品 当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线呈指数时被判定为可疑 当扩增曲线呈线性时判为阴性 可疑样品应当重新提取病毒核酸检测 如仍为可疑 可判为阳性 49 实时荧光RPA 重组酶聚合酶扩增技术等温扩增 37 42 C 用时短 20分钟灵敏度高操作简单 便携式仪器 2017 5 15 50 实时荧光RPA检测ASFV 特异性强与其他病毒无交叉反应敏感性高能检测出不同基因型的毒株 2017 5 15 51 实时荧光RPA检测ASFV 2017 5 15 与荧光PCR具有较高的相关性概率回归分析 最低可检测出17个拷贝 52 ASFV的基因型 22个基因型非洲22个型 西非I型为主 东非基因型复杂欧洲 I型意大利撒丁岛 II型东欧和俄罗斯 2017 5 15 53 2017 5 15 54 血清学检测方法 没有疫苗 抗体 感染没有中和抗体 感染早期既可以检测出抗体 7 12dpi 抗体持续很长时间 2017 5 15 55 血清学检测方法 筛选 ScreeningbyELISAtests OIE ELISA间接ELISA 基于半纯化病毒抗原商业化ELISA试剂盒INGEZIMPPACOMPACK3 INGENASA 使用VP73特异性单抗的阻断ELISASVANOVIR间接ELISA 重组抗原p30蛋白 IDScreen间接ELISA 包被p32 p62和p72蛋白 2017 5 15 56 确诊免疫印迹 Immunoblotting 半纯化病毒抗原间接免疫荧光 IFI E70毒株感染的传代细胞免疫过氧化物酶试验 IPT 病毒感染的细胞对操作人员的要求较高 血清学检测方法 57 免疫印迹 IB 方法 2017 5 15 58 间接免疫荧光 IIF 病毒感染细胞后加入待检测血清 再加入标记荧光素的蛋白A 2017 5 15 59 免疫过氧化物酶 IPT 60 非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒 国家外来动物疫病研究中心研发使用p30蛋白的优点适用于早期感染敏感性和特异性较高 CubillosC Gomez SebastianS MorenoN etal 2013 Africanswinefevervirusserodiagnosis ageneralreviewwithafocusontheanalysesofAfricanserumsamples VirusRes173 159 167 61 组分与用法 非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒 62 原理ASFV重组p30蛋白作为抗原包被奇数条作为检测孔 使用抗原稀释液包被偶数条作为对照孔 样品同时加入到检测孔与对照孔中 所测OD值之差用于结果判定 非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒 注 P表示阳性血清对照孔 N表示阴性血清对照孔 S1 S2 S3 S4等表示待检血清孔 63 检测步骤待检血清与阴阳对照血清使用样品稀释液做40倍稀释 在A1 A2和B1 B2孔中加入稀释后的阳性血清 50 L 孔 在C1 C2和D1 D2孔中加入稀释后的阴性血清 50 L 孔 在E1 E2加入稀释后的待检血清 50 L 孔 37 孵育60min 弃去反应孔中的液体 每孔用洗涤液清洗4次 洗涤液 1 300 L 孔 每次除去洗涤液后 在吸水纸上拍打 除去残留的液体 每孔加入酶标抗体 1 50 L 孔 37 孵育30min 重复步骤4 每孔加入底物溶液 50 L 孔 室温避光作用10min 10 每孔中加入50 L终止液 终止所有的反应 11 用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD450nm值 计算OD差 OD差 OD奇数孔 OD偶数孔结果判定阳性对照OD差 0 5 阴性对照OD差 0 2 试验结果有效 否则 应重新进行试验 待检样品OD差 0 5 判为阳性 待检样品OD差 0 5 判为阴性 非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒 64 血清学诊断小结 商品化和OIE ELISA对较高质量的血清样品检测均有较为满意的效果 检测溶血样品时特异性和敏感性降低阳性ELISA结果应该