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文档简介

RNA提取 高级生化与分子生物学研究技术 目录 1 试剂介绍2 主要提取流程3 详细步骤4 注意事项 1 试剂介绍 本实验室提取RNA常用的抽提剂是全式金Trizol Trizol是一种新型总RNA抽提试剂 可以直接从细胞或组织中提取总RNA 其含有苯酚 异硫氰酸胍等物质 能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶 Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性 因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用 2 主要提取流程 磨样 加氯仿 转移水相 加乙醇 室温晾干 保存 溶解RNA 测浓度 胶状物 加Trizol 去杂质 1 剪取新鲜幼嫩叶片 置于液氮中慢慢反复研磨 直至其成为合格粉末为止 2 加入1mlTrizol 晃动3 5下 再用枪吹打2 3下 确保全部裂解 3 室温放置5分钟 使样品充分裂解 12 000g 4 离心10分钟 4 每毫升Trizol加入0 2ml氯仿 猛烈晃动15秒 室温放置2 3分钟 5 12 000g4 离心15分钟 然后吸取上层无色水相至一新的离心管中 3 详细步骤 6 按1ml最初的Trizol加入0 5ml异丙醇 颠倒数次混匀 室温沉淀10分钟 7 12 000g 4 离心10分钟 弃上清 在管底可见RNA沉淀 透明胶状 8 每毫升最初的Trizol加入1ml75 乙醇 DEPC水配制 剧烈震荡 9 7 500g 4 离心5分钟 弃上清 再用离心机甩一下 5 000rpm 离心1分钟 小心吸尽液体 10 待RNA略干后 加入20 lDEPC水溶解 80 冻存 4 注意事项 1 所有离心管 枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染 耐高温器物可放置于150 烘烤4小时以去除RNA酶 其它器物去除RNA酶可考虑用0 01 的DEPC水浸泡过夜 然后灭菌 烘干 溶液需用DEPC水配制 2 必须戴一次性口罩和一次性手套操作 尽量不要对着RNA样品呼气或说话 以防RNA酶污染 3 提取RNA整个过程中 尽量在低温下操作 4 在操作中当加入变性剂氯仿后 须剧烈震荡 这样才能彻底使两相混匀 5 在提取核酸时 如样品浓度低 则应增加有机溶剂沉淀时间 80 下 30min
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