细胞培养技术++培训课件版.ppt

细胞培养技术 CellCulture 病理 肾脏 实验室白洁 细胞培养 概念 取动物组织 在体外 无菌条件下 模拟体内环境 营养 温度 pH值 气体 对其进行培养 使细胞能够生存 生长 保持原来生物学特性的一种实验方法 内容 细胞培养的基本条件细胞培养基本实验 一 细胞培养的基本条件 实验室条件 环境 设备 器材 试剂实验操作者工作范畴 无菌操作 温育 培养液配置 洗刷 无菌处理 细胞和用品储存等back 实验室条件 无菌环境仪器设备普通器材一般试剂 无菌室结构模式图 back 仪器设备 超净工作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 液氮罐 低温冰箱 重蒸水装置 负压真空泵 普通冰箱 消毒锅 烤箱 水浴锅 天平等back 二氧化碳培养箱back 超净工作台back 倒置显微镜 back 液氮罐 back 普通器材 玻璃瓶皿 玻璃瓶 培养瓶 培养皿 吸管 离心管 抽虑瓶等塑料瓶皿 多孔培养板 培养皿 培养瓶等 back 一般试剂 培养液平衡盐液消化液抗生素液pH调整液back back 培养液 使用培养液 天然培养基5 20 合成培养基80 95 附加成分再加适量抗生素液 调整pH值即可back 天然培养基 小牛血清胎牛血清组织提取液back 合成培养基 RPMI1640Eagle培养液 DMEM MEM IMDMHamF12 HamF10 PC199Mc Coy5Aback 附加成分 促贴壁物 层粘连蛋白等激素 胰岛素 氢化考的松 GH等生长因子 ECGF NGF FGF等酶抑制物 大豆胰旦白酶抑制剂等back 平衡盐液 HanksD HanksEarlePBSHBSSback 消化液 胰蛋白酶 0 125 0 25 胶原酶 0 1 0 3mg ml EDTA 0 01 0 02 back 抗生素液 链霉素 100ug ml 青霉素 100单位 ml 制霉菌素 100单位 ml 终浓度不超过万分之一为宜back pH调整液 5 6 NaHCO2HEPES1NHCL10 HAC1NNaOHback 无菌操作 洗手着装近火焰操作试剂瓶等斜放 实验前准备 清洗 玻璃 塑料 橡胶 金属类等消毒 无菌室 培养用液 培养器皿 玻璃 塑料 橡胶 金属 等 清洗示意图 白箭头 玻璃制品黑箭头 橡胶制品 back 消毒方法 物理消毒法 射线 紫外线 干热 湿热 过滤 煮沸等化学消毒法 乳酸 甲醛 过氧乙酸 新洁尔灭 乙醇等抗生素灭菌 二 细胞培养的基本内容 细胞传代培养 细胞冻存与复苏 细胞计数 血细胞计数器 手工计数细胞Coulter计数仪 自动计数计算 以活细胞计数 成团细胞算一个细胞数 4大格细胞数 4 104个 ml压线细胞计数原则 数上不数下 数左不数右 常规观察 培养液 颜色 含有指示剂酚红 颜色反应PH值新鲜的正常 PH7 2 7 4 桃红色 培养后 细胞产酸 变黄 需换液 透明度 清亮透明 混浊多为污染 悬浮细胞除外 培养液短期内变黄 1 是否有细菌污染 2 可能培养皿没清洗干净 有残留物 3 细胞生长太快 4 细胞接种量过大 细胞的生长状态 贴壁细胞随贴附支持物形状不同而形态各异 最常见的是贴附于平面支持物细胞 在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的 结构不明显 细胞在生长期常有1 2个核仁 在细胞机能状态不良时 细胞轮廓会增强 反差增大 若胞质中时而出现颗粒 脱滴和腔泡等 表明细胞代谢不良 悬浮细胞圆形 可以单个细胞或聚集成团生长 细胞透亮 核 膜分界清楚 可大量繁殖 镜下可见分裂期细胞 肉眼可见在培养瓶中可沉底 轻轻晃动后均匀分布 培养基清亮 培养生长不好时 聚集成团的细胞少 生长慢 细胞有皱缩 破碎 透光性降低等现象 微生物污染 传代或换液后24h 48h可观察到 细菌 真菌污染的典型表现 培养液混浊 液体内漂浮有菌丝或细菌 支原体污染 不明显 细胞生长明显变缓 胞质内颗粒增多 有中毒表现 但培养液多不发生混浊 细胞冻存与复苏 细胞冻存 缓慢 细胞复苏 快速 冻存和复苏的原则 慢冻快融 细胞冻存和复苏 优点 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力 经费 减少污染 减少细胞生物学特性变化 细胞冻存方法 配制冻存液 20 血清培养基 10 DMSODMSO溶解要产热 应提前配 避免伤细胞 DMSO的作用收集对数生长期细胞 加入适量冻存液 用吸管吹打成细胞悬液 1 106 5 106细胞 ml 加入1ml细胞于冻存管中 密封后标记冷冻细胞名称和冷冻批号 慢冻程序 原则 当温度在 25 以上时 1 2 min 当温度达 25 以下时 5 10 min 当温度达 100 时 可迅速放入液氮中 GMP程序 将冷冻管 管口朝上 放入纱布袋内 4 冰箱0 5h 20 冰箱0 5h 70 冰箱0 5h 转入液氮 简易程序 将冷冻管 管口要朝上 放入纱布袋内 纱布袋系以线绳 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口 按每分钟温度下降1 2 的速度 在40分钟内降至液氮表面 停30分钟后 直接投人液氮中 细胞复苏方法 l 从液氮中取出冷冻管 迅速投入37 38 水浴中 使其融化 1分钟左右 2 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 3 低速离心5