银杏叶总多酚抑菌效果的研究.doc

银杏叶总多酚抑菌效果的研究生物科学专业 学生：刘诗琴 指导老师：何丽芳摘 要：目的探究银杏叶总多酚对供试细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒杆菌）的抑菌活性。方法采用滤纸圆片法，测定银杏叶总多酚在不同质量浓度、pH值、温度下对供试细菌产生抑菌圈的直径大小。结果银杏叶总多酚对供试细菌有较强的抑菌活性，随着银杏叶总多酚质量浓度的增加，其抗菌活性显著增强；银杏叶总多酚对供试细菌的最低抑菌浓度不超过0.4mg/mL，最佳抑菌浓度为4mg/mL；在和中性和偏酸性PH条件下，抑菌活性较强；银杏叶总多酚溶液具有热稳定性，一定温度范围内处理不影响其抑菌活性。结论银杏叶总多酚具有较强的抑菌活性，可用于食品贮存与加工。关键词：银杏叶总多酚；供试细菌；抑菌浓度目前国内外抑菌方式主要集中在抑菌药物的研发上，青霉素、链霉素等抗生素类药物使用频繁，然而抗生素的大量使用会引发细菌耐药性、人体过敏反应等一系列不良后果1。因此，寻找一种无毒、高效的抑菌药物有着非常重要的临床意义。植物总多酚是一类广泛存在于各种植物体内的多酚类物质的总称，具有清除体自由基、抗脂质氧化、抗突变、防癌等生物学功能2-4。其中茶多酚、葡萄多酚是研究较多的素材，广泛地应用于食品、医药，精细化工研究等方面5-10。然而对于银杏叶总多酚抑制常见细菌作用效果的研究尚无报道。本研究以银杏叶总多酚作用于供试细菌（大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌），探究银杏叶总多酚的抑菌效果，为银杏叶总多酚的综合利用及开发提供参考依据。1 材料与方法1.1材料1.1.1实验仪器BCD-216YHN冰箱；SZ-93自动双重水蒸馏器；YX280A电热手提蒸汽消毒器；WP800TLZ3-K3微波炉；DHG-90LLOA型电热恒温鼓风干燥箱；SPX-150BSH-III生化培养箱；SWCJ-A洁净工作台；FA2004N电子天平。 1.1.2实验试剂牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌水、银杏叶总多酚粉末1.1.3供试菌种由本系微生物实验室提供：大肠杆菌（Escheriechia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、伤寒杆菌（Typhoid bacacillus）、枯草芽孢杆菌（Baeillussubtili）。1.2方法1.2.1悬菌液的制备吸取50 mL已灭菌的生理盐水于分别标有各种供试菌种的三角瓶中，再用接种环挑取少量不同菌种加入到对应的无菌试管中，震荡10 min，用血球计数板检测，控制菌悬液含菌约105 cfu/mL，备用（注：以上操作都需在无菌环境下执行，所需的玻璃器材均需120 高温灭菌30 min再烘干。）1.2.2最低抑菌浓度（MIC）的测定分别将灭菌后的滤纸圆片（直径为10 mm）置于质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的银杏叶总多酚水溶液中，浸泡12 h之后，取出，沥干，备用。向灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基分别加入100 L的菌悬液，然后再用三角玻璃涂布器涂布均匀。最后将沥干的滤纸圆片分别贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培48 h后观察是否出现抑菌圈。重复2个平板。以不加银杏叶多酚溶液只加菌悬液为对照。1.2.3最佳抑菌质量浓度的测定分别将灭菌后的滤纸圆片置于质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL的银杏叶总多酚水溶液中，浸泡12h之后，取出，沥干，备用。向灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基分别加入100 L的菌悬液，然后再用三角玻璃涂布器涂布均匀。最后将沥干的滤纸圆片分别贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培养48h后观察并测量抑菌圈直径大小。重复2个平板。将实验结果所得的最佳抑菌浓度设为以下实验中的银杏叶总多酚溶液的质量浓度。1.2.4 pH值对抑菌活性的影响将灭菌后的滤纸圆片置于用氢氧化钠和盐酸调配成6个pH值梯度（4- 5、 5- 6、6- 7、7-8、 8-9、 9-10）的银杏叶总多酚溶液中，浸泡12h之后，取出，沥干，备用。向灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基分别加入100 L的菌悬液, 然后再用三角玻璃涂布器涂布均匀。最后将沥干的滤纸圆片分别贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培养48 h后观察并测量抑菌圈直径大小。重复2个平板。1.2.5温度对抑菌活性的影响分别取最佳抑菌质量浓度下的银杏叶总多酚溶液10ml于6支试管中，然后分别在4、24、50、75、85、100六个温度下处理不同时间,再将灭菌后的滤纸圆片浸泡于各试管中12h，取出，沥干，贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培养48 h后观察并测量抑菌圈直径大小。重复2个平板。2 结果与分析2.1 银杏叶总多酚的最低（MIC）和最佳抑菌质量浓度的测定对银杏叶总多酚的最低抑菌浓度进行了测定，结果如表1所示，伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度为0.2mg/mL，大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4mg/mL。表1 银杏叶总多酚最低抑菌浓度试验结果大肠杆菌伤寒杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌E. coliT. bacacillusB. subtiliS. aureus质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation InhibitionMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameter1.0+13.61.0+12.81.0+13.41.0+13.40.8+12.40.8+12.40.8+12.40.8+13.80.6+12.20.6+11.80.6+11.80.6+11.40.4+10.80.4+13.60.4+10.80.4+12.60.2-10.00.2+11.20.2+11.40.2+10.80.1-10.00.1-10.00.1-10.00.1-10.0对照-10.0对照-10.0对照-10.0对照-10.0最低抑菌浓度(mg/mL)0.40.20.20.2注：滤纸圆片直径为10 mm，+为有抑菌活性；为无抑菌活性。最佳抑菌浓度如表2所示，在银杏叶总多酚的质量浓度为3.0mg/mL时，金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大，即为最佳抑菌浓度。大肠杆菌、伤寒杆菌和枯草芽孢杆菌的最佳抑菌浓度为4.0mg/mL，当银杏叶总多酚质量浓度达到4.0mg/mL以上时，抑菌圈的增大幅度较小，考虑到经济成本，选择4.0mg/mL银杏叶总多酚做后续抑菌稳定性试验。表2 不同梯度浓度的银杏叶总多酚抑菌试验结果大肠杆菌伤寒杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌E. coliT. bacacillusB. subtiliS. aureus质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation InhibitionMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameter8.0+18.68.0+13.88.0+17.88.0+12.27.0+16.27.0+14.67.0+15.67.0+14.46.0+18.46.0+15.66.0+17.46.0+13.85.0+16.85.0+14.85.0+18.45.0+15.44.0+17.84.0+16.44.0+20.64.0+14.83.0+15.43.0+14.83.0+16.23.0+16.42.0+15.22.0+14.22.0+14.42.0+14.21.0+13.61.0+12.81.0+13.41.0+13.4最佳抑菌浓度(mg/mL)4.04.04.03.02.2 pH值对银杏叶总多酚抑菌活性的影响图1.a可知，银杏叶总多酚在碱性环境条件下对大肠杆菌的抑菌效果比酸性条件下的抑菌效果好，在pH值为7-9条件下，抑菌效果较强，随着pH值得降低，抑菌效果减弱。由图1.bcd可知，当pH值为中性或弱酸条件下，其对伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较高，而当pH值为强酸或强碱时，银杏叶总多酚的抑菌活性降低。 a.不同pH值下对大肠杆菌的抑制效果b.不同pH值下对金黄色葡萄球菌的抑制效果 d. 不同pH值下对伤寒杆菌的抑制效果c.不同pH值下对枯草芽孢杆菌的抑制效果 图1 不同pH值下银杏叶总多酚对供试细菌的抑菌活性影响2.3 温度对银杏叶总多酚抑菌活性的影响银杏叶总多酚经不同温度处理后对供试菌种的抑菌效果，结果见表3所示。经低温长时间放置和高温短时间加热处理后，供试菌的抑菌圈变化不大，但当温度高于85时，其抑菌活性下降，可能是高温破坏了总多酚结构的缘故，银杏叶总多酚的抑菌活性与其结构密切相关。由此可知，银杏叶总多酚具有较好的常温抑菌活性。表3 不同温度对银杏叶总多酚的抑菌活性的影响 温度菌种抑菌圈直径（mm）42d241d502h7530min8510 min1002min大肠杆菌15.616.414.213.413.412.8伤寒杆菌16.415.813.814.214.212.6枯草芽孢杆菌17.217.615.414.812.811.2金换色葡萄球菌 15.415.612.812.613.311.8注：银杏叶总多酚质量浓度为4.0 mg/mL3 讨论抑菌试验选取了具有代表性的2种革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和2种革兰阴性菌大肠杆菌、伤寒杆菌作为试验材料，研究了银杏叶总多酚的抑菌作用。结果表明银杏叶总多酚具有广谱抑菌作用。金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为是0.2 mg/mL，大肠杆菌为0.4mg/mL。伴随银杏叶总多酚溶液的质量浓度增加，抑菌效果明显增强，并显示浓度-效应正相关关系，最佳抑菌浓度为4.0 mg/mL。pH值影响银杏叶总多酚的抑菌活性，银杏叶总多酚在中性或者偏酸性的环境下稳定，pH值为6-7的时候抑菌活性最强，随着酸碱度的增加，银杏叶总多酚的抑菌活性下降，可能是因为强酸强碱对试验菌有抑制作用，也可能与银杏叶总多酚抑菌活性成分的性质有关。低温长时间放置和一定范围内的高温短时间加热对银杏叶总多酚抑菌活性的影响不大，但过高的温度有可能破坏总多酚的结构，使抑菌效果降低。银杏叶总多酚是一种混合物，主要由花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸等多酚类物质组成11-12，要具体到银杏叶总多酚中何种物质对细菌起到抑制作用，还有待进一步的研究证明。此外，要将银杏叶总多酚作为一种食品添加剂或者作为抑菌药物实际使用，如何添加其用量，如何取得实际最佳的抑菌效果，尚需进一步的研究。【参考文献】1 仪淑敏.茶多酚对鱼糜制品的冷藏保鲜作用及抑菌机理D.杭州:浙江工商大学,2011,3(14):76-79.2 宋立江,狄莹,石碧.植物多酚研究与利用的意义及发展趋势J.化学进展,2000,12(2):161-1623 刘贤铭.植物多糖的抗肿瘤作用研究J.中国药房,2005,16(19):1502-1503.4 李莉.苹果多酚抗氧化性的测定J.安徽农业科学,2006,34(21):71-74.5 李春美,田燕,钟慧臻,等.芒果核提取物的抑菌活性组分分析J.武汉：华中农业大学食品科技学院,2011,3(3),172-175.6 彭慧琴,蔡卫民,项哨.茶多酚体外抗流感病毒 A3 的作用J.茶叶科学,2003,23(1):79-8l.7 Tapiero H, Tew K D. Polyphenols: Do They Play A Role in the Prevention of Human PathologiesJ. Biomed Pharmacother, 2002,56(1):200-207.8 刘运荣,胡建华.植物多酚的研究进展J.武汉工业学院学报,2005,4(12):64-65.9 王岳飞.茶多多酚解酒作用的实验研究J.茶叶,2003,29(3):145-147.10 王世红.银杏叶现代药理应用及其机制的研究进展J.基层中药杂志,2001,3(5):52-53.11 林清洪, 黄维南,林光荣,等. 银杏资源的合理开发与利用J. 福建农业科技,2006,4(3):15-16.12 江德安. 叶用银杏研究进展J. 孝感学院学报,2002,17(6):63-66.Study on Anti-microbial Activities of Total Polyphenol from Leaves of GinkgoStudent:Liu Shi-qin Tutor:He Li-fangAbstract: Objective The anti-microbial activities of total polyphenol from leaves of Ginkgo on test bacteria (Escheriechia coli、Staphylococcus aureus、Typhoid bacacillus、 Baeillussubtili aureus ) were studied. Method Measuring the diameter of inhibition zone under different conditions including concentration of total polyphenol from leaves of Ginkgo, pH value and temperature processing by filtering paper method. Results The total polyphenol from leaves of Ginkgo had strong inhibition on test bacteria, with the increase of the concentration of total polyphenol from leaves of Ginkgo, the anti-microbial activities increased significantly. The minimnm anti-microbial concentration of the total polypheol from leaves of Ginkgo was no more than 0.4mg/mL and the optimum anti-microbial conc