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PCR技术原理及其应用 1PCR技术原理 2PCR技术应用 2 第一节PCR技术原理 3 一 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 4 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 引物酶 引物酶 5 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 DNA聚合酶 DNA聚合酶 6 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 7 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 8 KaryB Mullis 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 9 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 10 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 11 72 94 55 PCR循环 12 二 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 13 PCRCycle Step1 DenaturationTemplateDNAbyHeat 95oC TargetSequence TargetSequence PCR原理示意图 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 14 PCRCycle Step2 Temperatureislowered Tm andprimersannealtotargetsequences TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 15 PCRCycle Step3 At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链 16 Endofthe1stPCRCycle Resultsintwocopiesoftargetsequence TargetSequence TargetSequence 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 17 TargetAmplification No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 4cycle 16Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 18 三 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 19 PCR仪 20 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 21 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 22 模板DNA 23 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 24 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 25 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 26 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq 27 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 28 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 29 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 30 以DNA为模板的反应反应体积 50 100 l缓冲液引物底物 4种dNTP模板 102 105拷贝TaqDNA聚合酶矿物油 四 PCR反应体系 31 以mRNA为模板的反应 逆转录PCR 逆转录反应体系体积 20 l缓冲液底物 4种dNTP引物 oligo dT 12 18模板 RNA逆转录酶其他试剂 RNA酶抑制剂 MgCl2 DTT 牛血清白蛋白PCR反应体系同以DNA模板的反应体系 32 一 PCR反应成分 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 一般100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 2 引物浓度0 1 0 5 mol L浓度过低影响产量 偏高引起错配和非特异性产物增加 且可增加引物二聚体的产生几率 3 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 34 4 dNTP20 200 mol LdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量 但特异性增加dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 0 5mmol L 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 36 10 50mmol LTris Cl缓冲液 72 时pH7 2 调节反应体系的pH值 使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 缓冲液含50mmol L的KCl可促进引物退火 大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构 6 PCR反应的缓冲液 37 二 循环参数 1 变性94oC 95oC 30 60s且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性5 10min 2 退火50oC 55oC 60 90s增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 38 3 延伸70oC 74oC 60 120s延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模板DNA的浓度 一般为25 35次次数过多 非特异扩增增加 39 三 PCR产物的积累规律 在PCR反应中 DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理 反应初期 目的DNA片段呈指数扩增 随着目的DNA产物逐渐积累 扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态 即出现 停滞效应 又称 平台期 到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数 PCR扩增效率 DNA聚合酶种类和活性 以及非特异产物的竞争等因素 到达平台期前 TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环 多数情况下 平台期在PCR反应中不可避免 40 PCR产物的积累规律示意图 41 一 一般原则 引物长度在15 30碱基 引物过短 会使特异性降低 过长会提高相应的退火温度 且合成引物的成本增加 引物中碱基的分布是随机的 避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列 G C含量宜在45 55 左右 五 PCR引物的设计 42 避免两引物间的互补 特别是3 端互补 以免形成二聚体 引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性 43 引物的3 端不能有任何修饰 也不能有形成任何二级结构的可能 引物的5 端限定着PCR产物的长度 可根据产物的要求不同 可以选用不同的引物修饰法 引物与非扩增序列的同源性不应超过70 44 直接提交模板序列到特定网页 如 http genome www2 stanford edu cgi bin SGD web primer http frodo wi mit edu 引物设计软件 功能 首先是引物分析评价功能 其中以 Oligo6 最为优秀 其次是引物的自动搜索功能 各种软件在这方面的侧重点不同 二 引物设计的方法 45 六 PCR产物的检测 一 琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离 纯化和鉴定最常用的方法 其分辨率很高 可测出1ngDNA 一般800bp以上的片段用0 8 的胶 800bp以下的片段用1 0 2 0 的胶 46 灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高 主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基因片段 因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测 适用于PCR扩增效率低时产物的检测 根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度 电泳后可用银染或溴乙锭染色检测 银染比EB染色检测灵敏度高2 10倍 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 47 高效液相色谱 HPLC 是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术 其特点是分离速度快 效果好 是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一 离子交换层析 IEC 的基础是溶质分子所携带的电荷 而合成的基因片段恰好具有这一性质 因此 IEC分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化 三 层析技术 48 为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段 或产物是否有突变 都需做分子杂交检测 分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交 点杂交灵敏度较高 特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析 Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性 检测灵敏度可达10ng 基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳 然后 印迹转移到尼龙膜上 再用标记的探针进行杂交检测 四 分子杂交 49 若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱 则可选择合适的限制酶消化PCR产物 再进行电泳分析 根据PCR酶切产物的电泳图谱 可判定PCR产物的特异性及是否存在突变 六 PCR扩增产物的直接测序直接序列分析是指在PCR扩增基因组DNA序列的基础上 直接进行基因核苷酸序列分析的方法 是检测基因突变最有效 最直接的方法 五 限制性内切酶酶切分析 50 七 PCR中应注意的事项 一 防止污染试剂小量分装吸头及Ep管一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作 二 设立对照 阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板试剂对照 除模板外的所有组分 八 PCR常见问题 无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性 52 第二节PCR技术应用 53 一 PCR技术的主要类型 反向PCR 锚定PCR 不对称PCR 原位PCR RT PCR 重组PCR 差异显示PCR 免疫PCR 实时定量PCR 多重PCR 54 1 反向PCR reversePCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 可对未知序列扩增后进行分析 如探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 55 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 56 2 不对称PCR目的 扩增产生特异长度的单链DNA 方法 采用两种不同浓度的引物 分别称为限制性引物和非限制性引物 其最佳比例一般是0 01 0 5 M 关键是限制性引物的绝对量 用途 制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究 57 高浓度引物 低浓度引物 58 3 RT PCR是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应 用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变 呈现mRNA多态性 克隆mRNA的5 和3 末端序列 以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库 59 mRNA cDNA 杂化双链 60 基因 mRNA 蛋白质多肽链 61 4 多重PCR 在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR 其结果是产生多个PCR产物 用于检测特定基因序列的存在或缺失 电泳 引物 62 5 实时荧光定量PCR real timePCR 美国PE PerkinElmer 公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的 与普通PCR相比 实时定量PCR具有许多优点 63 原理和方法利用Taq酶的5 3 外切酶活性 在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针 该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交 探针的5 端标以荧光发射基团FAM 荧光发射峰值在518nm处 靠近3 端标以荧光淬灭基团TAMRA 荧光发射峰值在582nm处 探针的3 端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸 当探针保持完整时 淬灭基团抑制发射基团的荧光发射 发射基团一旦与淬灭基团发生分离 抑制作用被解除 518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到 复性期探针与模板DNA发生杂交 延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动 当移动到探针切断 淬灭作用被解除 荧光信号释放出来 模板每复制一次 就有一个探针被切断 伴随一个荧光信号的释放 由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系 因此用该技术可对模板进行准确定量 64 实时PCR技术原理 65 荧光探针设计遵循原则 探针长度应在20 40个碱基左右 保证结合特异性 GC碱基含量在40 60 避免单核苷酸序列的重复 避免与引物发生杂交或重叠 探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度 因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5 另外 探针的浓度 探针与模板序列的同源性 探针与引物的距离都对实验结果有影响 66 特点FQ PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性 而且由于荧光探针的应用 可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果 所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性 克服了常规PCR的许多缺点 FQ PCR只须在加样时打开一次盖子 其后的过程完全是闭管操作 不需要PCR后处理 避免了常规PCR操作中的诸多弊端 67 1病原体测定由于PCR技术的问世 使得病原体检测能够快速而方便的进行 但由于其高灵敏性 实验操作很容易受到污染而出现假阳性 只要有微量病原体存在 PCR扩增即可为阳性结果 但并不能作为诊断依据 只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义 因此结模板定量显得特别重要 常规PCR由于不能定量而限制了其应用 然而PE公司研制的FQ PCR技术给解决这一问题提供了可能 目前该技术已经应用于丙肝病毒 人类乳头瘤病毒 结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究 Morris等用FQ PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒 HCV 进行了研究 FQ PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率 因此可作为一种检测HCV的有效方法 同时 由于FQ PCR可以测出血清中病原体浓度 故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据 68 以前常规检测大肠杆菌的方法 都因为繁琐 需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制 美国Witham等1996年将FQ PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究 针对不同血清变异型的大肠杆菌 他们设计应用不同的探针 从而提高了实验特异性 他们同时还对探针相对于引物的位置 反应液中探针浓度 镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验 以提高实验的准确性和精确性 由于TaqMan系统可以一次测量96管样品 还可对模板进行准确定量 又不需要进行电泳及EB染色后处理过程 实际应用方便 从而提高了实验的参考价值和应用价值 因此该实验方法是食品检测方面的一个突破 69 2 肿瘤研究意大利Gelmini等用FQ PCR技术检测乳腺癌标本c erbB 2基因拷贝数目变异情况 他们以 肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件 当扩增循环数在28 31之间时 RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系 他们在此条件下扩增了c erbB 2基因和 球蛋白基因 发现 RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系 虽然二者斜率不同 但是各个实验浓度下二者的 RQ之比却是恒定的 说明尽管二者发光效率不同 却不影响定量效果 他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性 n 25 r 0 94 P 0 01 70 3 基因表达研究由于TaqMan系统及荧光探针的应用 对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹 RT PCR定量法要方便 快速 准确得多 为了探测骨髓基质血小板生成因子 TPO 在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢 ITP 再生障碍性贫血 AA 和特发性血小板多症 ET 等疾病过程中的病理生理意义 日本Hirayama等用TaqManEZRT PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP AA ET病人的骨髓基质细胞TPOmRNA水平 又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度 结果显示ITP和AA病人TPOmRNA水平明显升高 而ET病人的TPOmRNA水平则正常 经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降 骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性 在正常人和ITP病人 TPOmRNA表达水平与巨核细胞