药用植物组织培养.doc

药用植物组织培养一、名词解释：1、初代培养:从植物体上分离下来的第一次培养叫初代培养，或叫第一代培养。2、继代培养：以后将培养物转移到新的培养基上进行培养称为继代培养，也可细分为第二代培养，第三代培养。3、药用植物组织培养: 是以现代生命科学理论为基础，结合化学学科的科学原理，采用先进的生物工程技术手段，以药用植物为研究对象，进行其组织器官的发生、培养和细胞融合、转化以及次生代谢产物和药材组培苗工厂化生产研究的一门新兴的综合性应用学科。4、外植体：是指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织和器官。5、培养基：根据植物营养原理和植物组织离体培养要求而人工配制的营养基质。它通常含有无机元素、维生素、氨基酸、糖类、植物生长调节物质、固化物、活性炭、天然提取的营养物、水组成。是植物组织生长的物质基础，也是植物组织培养能否成功的重要因素之一。6、愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。7、胚状体：指的是在植物组织培养中起源于一个非合子细胞（合子细胞：两性配子相融合形成的新细胞），经过胚胎发生和胚胎发育的过程形成双极性的胚状结构。 8、细胞分化:是细胞功能特化的过程9、细胞脱分化：是指一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象。即失去已分化细胞的典型特征。10、细胞再分化：是脱分化的分生细胞重新恢复细胞分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞。11、外植体：是指用于无菌培养的离体植物材料。即泛指第一次接种所用的植物组织、器官等一切材料。 选择合适的植物材料是进行组织培养关键的一步。 12、愈伤组织的继代培养： 愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，次生代谢产物的积累，原有的培养基已不适宜愈伤组织的生长，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做愈伤组织的继代培养。13、植物离体快速繁殖:是指利用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法，又称微体快繁。是常规营养繁殖技术的扩展与延伸。14、体细胞胚胎发生：利用各种体细胞组织，通过离体培养方式，诱导产生体细胞胚（还包括促进其发育、进行保存、促进发芽和成长为幼苗等）的过程和技术 15、人工种子：广义上讲，包括经过干燥或不经过干燥，不经包埋成球，直接播种发芽的体细胞胚。从狭义范围讲，是指将植物离体培养中产生的胚状体，主要是指体细胞胚，或能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织、胚状体等）。16：花药：是植物花的雄性器官，由两部分细胞组成：其一是体细胞，包括药壁和药隔组织细胞，属双倍体；其二是雄性细胞，即小孢子，一般称花粉粒，是单倍性细胞。 17：植物细胞培养：指以细胞或细胞团为单位进行的植物组织培养方式 。 其特点：操作简单、试验重复性好、单次试验群体大。18、机械法：叶组织是分离单细胞的最好材料。通常采用机械法和酶解法。18192019、酶解法：利用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞。20、分批培养：指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。21、连续培养：利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。22、病毒：是指在活体细胞内寄生增殖的不具细胞结构的生命体。只有在电子显微镜下才能观察到它的形状。23、无病毒;所谓的无病毒，通常指“特定无病毒或特定无病原菌”。因此无病毒苗是一个相对概念，并不是绝对不带任何病毒，只是不带有对当地生产危害最大的几种病毒而已。病毒粒子的类型杆状、线状（热处理效果较好）、球状24、植物细胞的全能性：是指任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的遗传信息，在适合条件下，具有形成完整植株的能力。25、组织细胞培养 ：植物组织细胞培养，主要是指植物各个部分组织、单个细胞或很小的细胞团和原生质体等的离体无菌培养。 26、碳 源 ：主要是用来提供培养物所需的碳骨架和能源，维持培养基的渗透压。二、多选题：1、离体的植物材料：器官、组织、细胞、原生质体2、组织细胞培养 ：（1）组织培养 （2）细胞培养 （3）原生质体培养3、植物组织培养技术根据培养目的划分 试管嫁接、试管受精、试管加倍 、试管育种4、分化 ：细胞水平的分化 、组织水平的分化、 器官水平的分化 、植株水平的分化 5、常用灭菌方法主要有物理法和化学法两种6、培养基灭菌方法有高压蒸汽灭菌和过滤灭菌7、稳定无菌培养体系建立、该时期主要包括：外植体选择、外植体灭菌、培养基选定和稳定化培养。 8、植株的热处理方法：（1）温汤浸渍处理（2）热风处理9、其他途径脱毒 ：1、愈伤组织脱毒 2、珠心胚培养脱毒 3、茎尖微体嫁接脱毒法 4、化学处理（又称化学疗法） 10、植物脱毒苗的检测方法： A：视觉观察法（植物直接测定法）B：生物鉴定法（指示植物法）C：抗血清鉴定法11、两种途径：胚胎发生和直接分化器官12、大量培养包括悬浮培养固相化培养13、单细胞培养包括平板培养法看护培养法微室培养法14、连续培养二种培养系统 封闭型系统和开放型系统15、病毒粒子的类型：杆状、线状（热处理效果较好）、球状三、简答题&论述题第一章 绪论1、什么是药用植物组织,有什么特点?药用植物组织培养: 是以现代生命科学理论为基础，结合化学学科的科学原理，采用先进的生物工程技术手段，以药用植物为研究对象，进行其组织器官的发生、培养和细胞融合、转化以及次生代谢产物和药材组培苗工厂化生产研究的一门新兴的综合性应用学科。特点：（1）经济高效，管理方便，利于集约化生产（2）技术含量高，试验误差小，人工控制能力强（3）生长周期短，生长速度快，试验重复性好（4）试验材料经济、来源单一 缺点：需要的设备复杂，投资相对较多，电能消耗大；对人员技术水平要求高，对试验场所要求较高，不能代替田间试验等2、组培技术在药用植物领域的应用）、进行药用植物的大规模快速无性繁殖，如铁皮石斛、金线莲等。）、建立基因库，保存药用植物的优良种质资源。）、培养无病毒的药用植物品种，促进良种栽培。）、培养单倍体植株，以获得药用植物新品种。）、生产药物活性成份。（人参细胞悬浮培养，工业化生产人参皂甙。用生物反应器生产抗癌新药紫杉醇。 （在农学、园艺、森林、药物学等应用学科A、缩短苗木繁周期B、快速繁殖如引进或新发现的稀有良种、濒危植物种苗的脱毒处理C、保存、繁殖优良种质D、诱导、筛选突变体E、克服远缘杂交的障碍）3、药用植物组织培养现状和趋势1）快速繁殖2）脱除病毒3）培育新品种4）植物种质资源的保存5）人工种子的研究6）次生代谢产物的生产4、解释植物细胞的全能性：是指任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的遗传信息，在适合条件下，具有形成完整植株的能力。即它包含了3层含义 ：（1）植物细胞无论是体细胞和生殖细胞均具有该物种的全套遗传信息。 （2）只有在适宜的条件下，植物细胞才具有发育成完整植株能力。 （3）植物每个细胞均具有发育成完整植株的能力。第二章植物组织培养室的建设与一般操作技术1、组培室设计1）首先要明确建组培室的目的；2）确定建设规模；3）确定建设的档次组培室设计的基本原则：根据具体情况和条件、工作的性质和任务，灵活设计。应考虑以下问题： 1）组培室的选址：应选在安静、清洁，无环境污染，且交通方便的城镇近郊。2）分区布局：一般按工艺流程顺序排列3）分区大小、比例及其产量预测4）培养室光照与温度控制2、组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？分析天平、电子称、冰箱、容量瓶、量筒、滴瓶、量杯、称量瓶、母液存贮瓶和玻棒等；培养基制备室：纯水仪、高压灭菌锅、灌装机、酸度计、组培瓶和量杯等；培养基存放室 基本要求：干净、密闭、具有温、湿度调节、杀菌功能。3、植物组织培养实验室组成，应具有哪些功能区1）洗涤室2）化学实验室 (药物称量)3）培养基制备室 4）灭菌室 5）培养基贮藏室 6)缓冲室 7)接种室（无菌操作室） 8)培养室 9)观察室（细胞学观察） 10)温室 培养基存放室：基本要求：干净、密闭、具有温、湿度调节、杀菌功能。接种室：基本要求：干净无菌、密闭、光线好。4、外植体的种类（1）带芽的外植体：包括顶芽、腋芽、根茎连接处的萌蘖。带芽外植体适合植物的离体快速繁殖。（2）胚：指自然状态和试管中精卵融合受精后形成的各时期的胚。（3）分化的器官组织、二倍体组织（4）花粉及雌配子体中的单倍体细胞 （只有体细胞中一半的染色体）第三章 植物材料1、外植体的选择基本要求（1）植物的种质选择：选生产上或研究上意义比较大的种质，选择具有良好表型的植物，如抗逆性强、品质好等。 （2）外植体的增殖能力：外植体必须有良好的增殖能力，并且在培养基中继续筛选增殖能力最强的材料。（3）外植体的大小：茎顶或茎段0.5-1.0cm，叶片0.5-1.0cm见方，茎尖、胚、胚乳等则按组织或器官单位切离即可，用于脱毒培养的茎尖一般0.2-0.5cm。（4）外植体的年龄和着生部位：一般来源于幼年植物的外植体要比来源于成年树的外植体容易培养。对于同一株植物从幼年到成年转变是由基部向顶部转变的，木本植物基部通常是幼年期，顶部是成年期，中部则是中间类型。（5）取外植体的季节和时间：一般处于生长季，较幼嫩的外植体培养容易。（6）木本材料的特殊性：木本植物是一个高度分化的多年生植物，开展组织培养难度增大，具体表现为： 纯系比较难获得；年龄效应明显；位置效应明显；多年田间生长，杂菌感染严重；木本植物材料经常出现深休眼。2、一般植株外植体表面灭菌基本程序 如何获得无菌材料材料采取（田间或室内） 用毛笔在流水下冲洗 在超净工作台上用70%酒精浸泡1530s 无菌水洗净残留的乙醇 灭菌剂表面消毒用无菌水清洗干净（5次以上） 无菌外植体 接种在培养基中初代培养 再生体系建立 3、如何获得成熟组织培养的成功（1）外植体小型化 因为离体培养的细胞需要中断和邻近细胞的有机联系才可体现其细胞全能性。 （2）离体培养物的连续继代 采用短的继代培养周期，经过连续的多次切割培养会使培养物复壮（幼化）程度大大提高。 （3）添加植物生长调节物质，如BA、NAA等可以促进外植体的复壮第四章培养基及其制备1、培养基由哪些部分组成，如何配制？为什么在配制培养基时先要配成较浓的混合母液？1)无机营养物2)有机营养成份(碳源 维生素)3)有机附加物4)生长调节物质母液的配制）、大量元素（10，20 ）、微量元素（100 ，200 ）、有机物（ 100 ，200 ）、植物生调节物质培养基制备程序示意图：培养基需经常配制，为减少工作量，便于低温贮藏，一般配制成比所需浓度高10100倍的母液，配制培养基时只要按比例即可。第五章植物愈伤组织培养1、愈伤组织培养对外植体有何要求？1）那一部分器官最适于作为组织培养材料来源 2）器官的生理状态和年龄3）取材的季节适宜 4）外植体大小 5）取得离体材料的植株重量 6）植物细胞具有全能性2、愈伤组织形成的过程：诱导期：是外植体细胞进行分裂的准备时期，也是愈伤组织形成起点。诱导期一般一至数天。分裂期：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。形成期：是指外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织。3、优良的愈伤组织具有的特性 1）、高度的胚性2）、容易散碎3）、旺盛的自我增殖能力4）、经过长期继代保存而不丧失胚性4、植物生长调节物质配比模式（为促使愈伤组织再分化应怎样调整生长素和细胞分裂素比值。生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向:是愈伤组织、长根还是长芽。生长素/细胞分裂素1）高利于根的形成2）适中利于愈伤组织的形成3）低利于芽的形成 5、愈伤组织形态发生的两种方式，比较他们完整植株的异同1）不定芽方式2）胚状体方式 （二）、胚状体方式 在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。 胚状体是双极性的、有共同的维管束贯穿两极，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。区别：胚状体具有两极性，即有茎端和根端。胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。第六章植物离体快速繁殖1、植物离体快速繁殖的意义优点植物离体快速繁殖既是改良品种，培育新品种的一种手段；又是快速繁殖良种，以获得大量优质苗木的一种方法。它不仅保持了常规营养繁殖方法的全部优点，还具以下优点：1）、繁殖系数高，繁殖周期短，繁殖速度快2）、应用广泛，是推广良种的重要手段3）、繁殖材料用量少，不受季节限制，可实现工厂化生产4）、能获得无病毒苗 5）、木本植物应用潜力更大2、植物离体快速繁殖的基本程序1）、稳定无菌培养系建立时期2）、稳定培养系的增殖、生长和增壮时期3）、诱导茎芽生根形成小苗时期4）、移栽和驯化时期3、植物离体快速繁殖的影响因素内因：1）外植体：基因型、外植体的类型及其生理状态、外植体的大小，取材的年龄及生理状况等。2）继代培养次数：继代培养次数多，器官建成能力下降。3) 愈伤组织的遗传特性及其生理状态：培养基的成分及培养条件均影响愈伤组织的生理状态，进而影响其再生能力愈伤组织在增殖培养基上培养的时间越久或代数越多，转移到分化培养基上时，形态发生会越困难以至于丧失愈伤组织块过大也不利于分化因此：一般取生长旺盛的愈伤组织进行转分化培养4）芽的增殖途径a) 嫩稍扦插增殖途径b) 丛生芽增殖途径c) 器官发生途径d) 胚状体途径e) 原球茎（类胚组织）途径 （兰科）外因：a、培养基：研究培养基成分的改变：氮源、碳源、外源激素以及培养基的大量元素和微量元素b、培养条件：光照、温度、培养容器类型、大小及容器内气体的成分和数量等。 操作技术4、植物离体快速繁殖的问题与对策1)污染：防污染的对策对A、外植体进行预培养B、外植体的灭菌C、规范繁殖程序D、规范操作2)外植体褐变 :防止褐变的对策A、外植体的预处理 B、培养基中加入抗氧化剂 C、选择合适培养基 D、 多次连续转移培养3)试管苗的玻璃化:试管苗的玻璃化现象及对策:玻璃化现象在植物组织培养过程中发生普遍，但目前对玻璃化形成的原因和机理还不明确。4)遗传稳定性:提高遗传稳定性的对策A、在进行植物离体快繁时，应尽量采用不易发生体细胞变异的增殖途径，以减少或避免植物个体或细胞发生变异，如采用生长点培养、腋芽增殖、胚状体途径，可有效减少变异。B、取幼龄的外植体材料，缩短继代时间，限制次数，每隔一定继代次数后，重新接种新的外植体进行继代培养。5)试管苗的移栽成活: 玻璃化现象在植物组织培养过程中发生普遍，但目前对玻璃化形成的原因和机理还不明确。提高遗传稳定性的对策6)遗传稳定性:组培成本问题及对策: 组培成本问题及对策A、 糖成本问题与对策：糖种类、数量 B、 光照与能源问题：自然光、保温、控光与改变光照等C、 培养用水问题与对策D 、培养器具、材料成本问题与对策 E、培养程序简化问题第七章体细胞胚胎发生1、什么是体细胞胚胎发生？有什么特点和作用？利用各种体细胞组织，通过离体培养方式，诱导产生体细胞胚（还包括促进其发育、进行保存、促进发芽和成长为幼苗等）的过程和技术。特点：（1）体细胞胚具有两极性（2）遗传性相对稳定（3）生理隔离，重演受精卵形态发生的特性（4）体细胞胚胎发生具有普遍性作用：（1）为植物细胞分化、全能性表达过程和机理等重大问题的研究提供了理想的试验材料（2）是促进离体快速繁殖、实现田间和温室栽培的重要途径（3）实现资源保存，为挽救濒危植物提供了可能(4)遗传上稳定再生频率高，是多数植物最理想的转化受体系统。（5）为突变体的筛选提供新的来源（6）为细胞分化和植株再生等奠定基础。2、影响体细胞胚胎发生的因子有哪些？1）外植体2）培养基3）培养环境1）、外植体：（1）基因型（植物种类）（2）生理状态（年龄、生长季节）（3）部位（器官和组织）（4）培养时间 2）培养基：（1）生长调节物质 （激素调控）生长素：吲哚乙酸（IAA）、苯乙酸（2，4-D）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）等。生长素对体细胞胚胎发生的机制是诱导一些特异性多肽或蛋白质形成。还原性氮盐和外源氨基酸 （2）其它物质对胚状体形成的作用 （天然提取物：如椰子乳汁 和活性炭、 淀粉类物质作用、金属离子、稀土元素、微量元素的作用 ）3）培养条件：光照：光强、光照时间、光质 温度：24-283、什么是人工种子？其基本构造如何？如何制作？广义上讲，包括经过干燥或不经过干燥，不经包埋成球，直接播种发芽的体细胞胚。从狭义范围讲，是指将植物离体培养中产生的胚状体，主要是指体细胞胚，或能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织、胚状体等）。基本结构：一胚状体二人工胚乳三人工种皮制作：主要包括：体细胞胚的诱导、包裹制种与发芽试验。以海澡酸钠包裹体细胞为例基本程序为：外植体的选择与灭菌 愈伤组织诱导 体细胞诱导体细胞的同步化体细胞胚的分选体细胞胚的包裹（人工胚乳）外膜包裹（人工种皮）贮藏发芽成苗试验体细胞变异程度与农艺研究。关键点：高质量体细胞胚诱导和人工种皮材料的选择4、人工种子优点1）、不受自然环境的影响，一年四季均可进行生产，还可节省大面积种子田。2）、繁殖速度快、能大大提高育种效率，缩短育种时间3）、在制作过程中，可以有目的的在营养物质里加进生长激素、菌肥、农药等，从而促进植物生长发育，增强抗旱、耐寒、抗病虫害等抗逆能力，提高品质4）、固定杂种优势。人工种子在本质上属无性繁殖，一旦获得优良基因型，可以保持杂种优势。5）、不易霉变，便于运输和贮存 第八章植物花药和花粉培养1、植物花粉和花药培养有什么意义？花药包括花粉(含精子)和花药壁(为体细胞),所以花药离体培养可能产生单倍体和双倍体,而花粉培养只能产生单倍体。但是两者都可以在培养中诱导形成单倍体的细胞系，并可获得单倍体植株意义(单倍体培养) 就是花粉培养能极早稳定分离后代，缩短育种周期； 在同一选择周期中，单倍体选择效率要比二倍体高； 隐性性状得以纯合表现 ；花药培养和花粉培养既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性；可以用于构建现代分子遗传学研究的群体(纯合双体) 。2、影响植物花粉和花药培养的因素有哪些？ 1）、材料基因型：不同的植物，对花培的反应极为不同。2）、花粉发育时期：接种花药的花粉发育时期，是决定花药培养能否成功的关键因素3）、培养基的作用：（1）基本培养基 花药培养同其他组织或器官用的培养基是一样的，（2）植物生长调节剂的作用 在培养基中，起关键作用的主要是激素4）、糖对于花药培养的作用：糖对于花药的培养也是不的可缺少的，糖的作用主要是提高碳源和调节渗透压的作用。5）、有机附加物 有机附加物对花粉发育有着一定的作用。6）、活性炭的作用 7）、培养基中PH值对培养效果的影响 8）、培养条件第九章 细胞培养及药用植物次生代谢产物生产1、无病毒良种种苗的优点（1）产量提高 通过脱毒可大大提高作物的产量。（2）提高品质：增强抗病性：提高植物本身的抗性，如抗虫、抗病、抗线虫等（可以脱去类病毒、细菌、真菌等）。脱毒杭白菊生长旺盛，没有病虫害， 菊花又多又大，重瓣，品质好。是专供出口的真正绿色产品。（3）抗病性增强脱毒后，植物本身抗性提高、对病虫的抗性增强