呼吸系统疾病动物模型1.ppt

呼吸系统疾病动物模型 2010342062石晓征 呼吸系统疾病是一种常见病 多发病 主要病变在气管 支气管 肺部及胸腔 病变轻者多咳嗽 胸痛 呼吸受影响 重者呼吸困难 缺氧 甚至呼吸衰竭而致死 在城市的死亡率占第 位 而在农村则占首位 更应重视的是由于大气污染 吸烟 人口老龄化及其他因素 使国内外的慢性阻塞性肺病 简称慢阻肺 包括慢性支气管炎 肺气肿 肺心病 支气管哮喘 肺癌 肺部弥散性间质纤维化 以及肺部感染等疾病的发病率 死亡率有增无减 咳嗽动物模型支气管哮喘动物模型慢性支气管炎模型肺气肿和肺心病动物模型肺水肿动物模型肺纤维化动物模型肺结核病动物模型肺硅沉着症动物模型 第一节咳嗽动物模型 咳嗽是呼吸系统多种疾病的常见症状 确定受试药物的镇咳作用 可采用小鼠氨水或二氧化硫引咳法及豚鼠枸橼酸引咳法两种模型加以确定 并与阳性药物进行同步观察 豚鼠是筛选镇咳药 antitussives 的常用动物 小鼠和大鼠给予化学刺激虽然能诱发咳嗽 但其咳嗽与喷嚏动作很难区别 变异较大 特别是反复刺激时变异更大 故小鼠主要作为初筛镇咳药时使用 一 小鼠氨水引咳法 造模原理 浓氨水是一种较强的化学刺激物 动物吸入氨水气雾后 刺激呼吸道感受器 引起咳嗽 动物和主要器材 成年小鼠 性别不拘 500ml玻璃罩 空气压缩机 或脚踏风箱 操作步骤 1 小鼠置玻璃罩内 空气压缩机以400mmHg恒压将氨水喷入罩内 喷雾5s 记录动物咳嗽潜伏期和2min内咳嗽次数 也可用引起一半小鼠咳嗽的喷雾时间 FDT50 为指标 2 观察药物的止咳作用小鼠按体重均分3组 每组至少15只小鼠 给药组灌服受试药 模型组灌服等体积生理盐水 阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因30mg kg体重 灌胃给予受试药1h后 腹腔注射给予受试药30min后开始喷雾 喷雾一定时间 终止喷雾 观察咳嗽反应 模型评价与注意事项 1 氨水诱发小鼠咳嗽反应变异性较大 可在初筛止咳药时应用 2 咳嗽潜伏期是指从喷入氨水开始至发生咳嗽所需的时间 秒数 小鼠咳嗽以腹肌收缩 缩胸 同时张大嘴为准 有时可有咳嗽声 观察必须仔细 也可用听诊器听咳嗽声 3 避免腹腔注射给予受试药 以免干扰动物的咳嗽反应 二 小鼠二氧化硫引咳法 造模原理 二氧化硫是一种强的化学刺激物质 动物吸入其气雾后刺激呼吸道感受器 反射性引起咳嗽 无水亚硫酸钠与硫酸反应生成SO2 操作步骤 用一带侧口的三角烧瓶 侧口通过橡皮管与球囊连接 烧瓶内盛有无水亚硫酸钠 烧瓶塞上装一滴定管 内灌硫酸 打开滴定管的活塞使硫酸滴到亚硫酸钠上 在烧瓶内产生SO2气体 气体储存于球囊内 用血管钳夹紧 应用时用注射器吸取4 10ml 注入放置实验小鼠的广口瓶内 3 观察药物的止咳作用小鼠按体重均分3组 给药组灌胃给予受试药 模型组灌胃给予等体积生理盐水 阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因30mg kg体重 灌胃给予受试药1h或腹腔注射给药30min后 将小鼠置于充满SO2的烧杯内 观察咳嗽潜伏期 按下式计算药物止咳率 给药组咳嗽潜伏期药物止咳率 100 模型组咳嗽潜伏期 注意事项 1 烧杯内SO2的浓度要求在1 50000 该浓度足以引起咳嗽 如浓度过高 如1 10000 易造成动物中毒死亡 2 实验中SO2产生的多少与实验室温度 无水亚硫酸钠的量关系密切 故无水亚硫酸钠的称量应准确 3 SO2引咳的个体差异较大 实验时应尽量减少各方面误差 三 豚鼠枸橼酸引咳法 造模原理 豚鼠吸入枸橼酸溶液喷雾后 刺激呼吸道粘膜感受器 反射性引起咳嗽 动物和主要器材 体重200 250g豚鼠 2 4L玻璃罩 空气压缩机 豚鼠体型短粗而圆 头较大 眼大而圆还明亮 耳圆 上唇分裂 耳朵短小 四肢短 前脚具4趾 后脚3趾 无外尾 操作步骤 1 将豚鼠置于玻璃干燥器内 用超声雾化器喷入17 5 枸橼酸雾化气5 10s 观察 记录豚鼠咳嗽潜伏期或记录5min内豚鼠的咳嗽次数 2 观察药物的止咳作用将豚鼠按体重随机分为3组 给药组灌胃给予受试药 模型组灌胃给予等体积生理盐水 阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因5mg kg体重 灌胃给予受试药1h或腹腔注射给药30min后 按上述方法引咳 评受试药的止咳效果 模型评价与注意事项 1 豚鼠对化学性刺激物很敏感 刺激后能诱发咳嗽 动物容易得到 二氧化硫引咳法 氨水引咳法和枸橼酸引咳法是研究止咳药的三种常用方法 前二者系用小鼠 费用较低廉 适合于研究止咳药效果的初筛 确定效果后 再用豚鼠作进一步研究 2 豚鼠的咳嗽声响亮 应以能听到声音为咳嗽 3 实验前1日豚鼠应预先挑选 喷雾后5min内咳嗽次数少于10次者应予以淘汰 第二节支气管哮喘动物模型 支气管哮喘 bronchialasthma 简称哮喘 是气道的一种慢性变态反应性炎症性疾病 哮喘是由嗜酸性粒细胞 肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症 由此导致患者的气道高反应性 气道对各种刺激因素出现过强或过早的收缩反应 造成气道缩窄 气流受阻 临床上表现为反复发作性喘息 呼气性呼吸困难和胸闷等症状 哮喘是一种常见疾病 全球约有1亿5千万 我国约有1千5百万哮喘病人 已成为严重威胁人类健康的疾病之一 哮喘的发病机制尚不完全清楚 有许多因素参与 过去认为哮喘是IgE介导的I型超敏反应性疾病 目前认识到哮喘是以气道高反应性为主要特征的慢性气道炎症性疾病 哮喘发病分为速发相和迟发相两个阶段 速发相阶段 肥大细胞是主要效应细胞 致敏抗原与肥大细胞表面IgE抗体结合 当相同抗原再次进入机体后 引发肥大细胞脱颗粒 释放组胺 5 羟色胺等炎症介质 导致支气管痉挛 气管粘膜微血管通透性增加 气管粘膜水肿和粘液分泌亢进 迟发相反应 特征是大量嗜酸性粒细胞局部浸润 一 过敏性哮喘模型 造模原理 过敏性哮喘 allergicasthma 的发病机制涉及引起过敏的抗原 抗原一般具备两种特性 一是免疫原性 即能刺激机体产生免疫应答 包括特异性抗体和致敏T细胞 二是抗原性 系指能与抗体或致敏T细胞在体内外发生特异性结合 过敏性哮喘模型的复制需要致敏和激发两个步骤 动物以卵清蛋白 ovalbumin 卵白蛋白 为致敏的抗原 有时并用免疫佐剂如氢氧化铝 灭活百日咳杆菌菌苗等 经腹腔或皮下注射 刺激机体产生IgE 并结合在肥大细胞等细胞表面 使机体处于致敏状态 一定时间后当动物再次接触到相同抗原后 发生I型速发型过敏反应 呼吸道粘膜肥大细胞等合成并释放多种生物活性物质 引起支气管平滑肌收缩 粘液分泌增多 血管通透性增高和炎症细胞浸润等 激发 导致哮喘发作 一 腹腔注射致敏剂豚鼠模型 动物 试剂与器材 体重250 300g豚鼠 雌雄不限 10 和0 5 1 卵清蛋白生理盐水溶液 超声雾化器 操作方法 1 致敏腹腔注射10 卵清蛋白生理盐水溶液1 0ml 含卵清蛋白100mg 使豚鼠处于致敏状态 2 激发注射卵清蛋白后2周 将豚鼠置于密闭有机玻璃箱内 用0 5 1 卵清蛋白生理盐水溶液超声雾化吸入30s 2min 诱发豚鼠哮喘发作 3 支气管 肺泡灌洗 结果及模型评价 1 豚鼠可出现气喘表现 咳嗽 烦躁 口唇和四肢紫绀 呼吸费力挣扎 呼吸频率加快和呼吸加深 病理检查可发现肺毛细血管扩张 嗜酸性粒细胞浸润和腺体分泌亢进 2 豚鼠是能最好显示气道高反应性的动物 其哮喘发作与人类的表现相似 3 用于复制过敏性哮喘动物模型的抗原物质主要有卵清蛋白 蛔虫卵 尘螨 豚草花粉 真菌孢子 蟑螂等 卵清蛋白为蛋清提取物 免疫原性强 来源方便 价格低廉 最常用于复制哮喘模型 4 卵清蛋白激发豚鼠哮喘发作是目前国内外常用的方法 操作简单 可重复性强 本模型主要用于哮喘发病机制研究和治疗效果观察 动物每日引喘1次 反复10 14d 可成为哮喘慢性发作模型 5 本模型最大的缺点是豚鼠对卵清蛋白反应的个体差异很大 少数豚鼠可能不出现哮喘反应 而一些动物则可发生急性过敏性休克 注意事项 1 宜选用等级高 溶解性好的卵清蛋白 2 超声雾化器应气雾流量较大 雾化颗粒较小 3 激发用的抗原量和吸入时间非常重要 雾化吸入的卵清蛋白溶液必须用较低浓度 以减少动物死亡 4 动物一旦出现腹肌明显收缩 应立即将其移出有机玻璃箱 以免因窒息而死亡 二 哮喘离体实验方法 一 豚鼠气管片法 基本原理 将制备的气管片置于盛有营养液的恒温浴槽内 加一定负荷 通过拉力换能器 将致痉剂或受试药对气管作用所产生的张力转换为电信号 放大后由记录仪描记出标本的舒缩曲线 可反映大气道的舒缩变化 取出气管 制备气管片 制备气管螺旋条 连接到描记装置供氧的离体器官浴槽内 观察药物作用加组胺或乙酰胆碱 气管条张力达到最高点时 分别加入不同剂量受试药 记录气管条张力变化 求受试药的解痉百分率给药前曲线高度 给药后曲线高度解痉百分率 100给药前曲线高度 第三节慢性支气管炎模型 慢性支气管炎 chronicbronchitis 简称慢支 是指气管 支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症 临床上以反复发作咳嗽 咳痰或伴有喘息症状为特征 且症状每年至少持续3个月 连续两年以上 病情持续多年者常并发肺气肿和慢性肺心病 慢支的病因和发病机制较复杂 是由多种因素长期综合作用所致 已确定的致病因素包括细菌和病毒感染 吸烟 空气污染 过敏和机体内在因素等 一 大鼠烟熏模型 造模原理 烟雾中含有许多有害物质 如焦油 CO 尼古丁及氧化物等 它们随烟雾被吸入支气管 抑制粘膜上皮细胞的纤毛运动 刺激分泌增加 降低巨噬细胞的吞噬功能而有利于感染 随着烟雾刺激时间的延长 气管炎症逐渐加重 一般在21d后开始出现呼吸道慢性炎症 约至第7周可形成慢性支气管炎的典型病理变化 操作方法 成年雄性大鼠 将大鼠置于27m3烟室内 吸入混合烟150 200mg m3 200g锯末 15 20g烟叶 6 7g干辣椒及1g硫磺混合 20 30min内烧化 颗粒在0 5 1 m以上 每周吸入6次 44d后即可形成慢性支气管炎病变 第四节肺气肿和肺心病动物模型 阻塞性肺气肿 简称肺气肿 是呼吸性细支气管 肺泡管 肺泡囊和肺泡因过度充气呈持久性扩张 并伴有肺泡间隔破坏 肺组织弹性减弱 导致肺体积膨大 功能降低的病理状态 肺气肿常继发于其他肺阻塞性疾病 尤以慢性支气管炎最为常见 肺气肿发病机制与慢性支气管炎引起的呼吸道阻塞 特别是小气管 体内 抗胰蛋白酶或 巨球蛋白缺乏 遗传因素 变态反应等有关 目前复制肺气肿动物模型的主要方法有利用弹性蛋白酶 木瓜蛋白酶 氯化镉 饥饿 吸烟诱发肺气肿和转基因肺气肿模型等 肺源性心脏病 corpulmonale 简称肺心病 是呼吸系统的常见病 是指由支气管 肺组织 胸廓或肺动脉病变引起肺血管阻力增加 产生肺动脉高压等多种因素的心脏病 根据起病的缓急和病程长短 可分为急性和慢性两种 以后者为多见 一 弹性蛋白酶诱发兔肺气肿模型 造模原理 肺组织中参与肺泡壁降解的蛋白酶主要是弹性蛋白酶 elastase 弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子 主要为 抗胰蛋白酶 失平衡可能在肺气肿发生中起一定作用 在正常情况下 弹性蛋白酶抑制因子可以抑制此酶的活性 使弹性蛋白酶与弹性蛋白酶抑制因子之间处于平衡状态 维持肺组织正常结构 避免肺气肿的发生 但当弹性蛋白酶活性过强时可造成肺气肿 本模型主要基于肺气肿形成的弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子之间的失平衡学说 弹性蛋白酶注入肺内后 穿越肺泡上皮细胞进入肺间质 降解弹性纤维 从而形成肺气肿 操作方法 体重2 5 3 0kg雄性新西兰白兔 1 家兔用氯胺酮麻醉后 仰卧位固定在操作台上 将内径3 0mm的气管插管插入家兔气管内 2 经气管插管缓慢注入胰弹性蛋白酶2000U kg体重3ml 将兔直立旋转 使药液均匀分布于两肺内 3 气管内注入胰弹性蛋白酶后2 4和6周分别处死动物 切取肺组织 在10 中性缓冲甲醛液中固定后 常规制备石蜡切片 观察肺病变 4 用图像分析仪进行形态定量分析每只动物观察2张切片 每张切片随机观察测量8个视野 测量平均肺泡面积 单位面积肺泡数和平均内衬间隔 结果 注入胰弹性蛋白酶后2周 肺组织充血 水肿 各级支气管 血管周围 肺间质内有大量中性粒细胞 巨噬细胞等炎症细胞浸润 4周时上述改变进一步加重 部分肺泡腔明显扩大 6周时 呼吸性细支气管 肺泡管 肺泡囊及肺泡扩大 肺泡壁变薄 断裂 有的已融合成肺大泡 形成中度肺气肿 注意事项 1 在弹性蛋白酶诱发肺气肿模型时 目前应用较多的弹性蛋白酶为猪胰弹性蛋白酶 也可使用从人中性粒细胞中提取的弹性蛋白酶 前者作用较强 2 可有多种给药途径给弹性蛋白酶 如雾化吸入 气管穿刺滴入 气管插管滴入和静脉注射等 二 野百合碱诱发大鼠肺心病模型 造模原理 野百合碱能损伤肺小动脉内皮细胞 引起动脉壁增厚 管腔缩小 血管阻力增加 使右心负荷加重 导致肺心病 主要试剂 用纯乙醇与生理盐水 体积比2 8 混合液配制2 野百合碱水溶液 操作方法 雄性成年大鼠 对照组大鼠腹腔注射等体积纯乙醇与生理盐水 体积比2 8 混合液 模型组大鼠一次性腹腔注射2 野百合碱水溶液60mg kg体重 结果 对照组大鼠肺血管内皮细胞扁平 连续 分布均匀 大小 薄厚较一致 注射野百合碱后13d即可出现肺心病 可见肺血管明显损伤 内皮细胞变性肿胀 突向管腔 甚至坏死脱落 肺内肌型动脉中膜比例增大 血管壁增厚 管腔变窄 有的可完全闭塞 可见血管周围炎 另外右心肥大指数增加 第五节肺水肿动物模型 肺水肿 pulmonaryedema 是指液体在肺泡间质和 或 肺泡内过多聚积所致的综合征 肺水肿是常见的危重急症 可由多种原因引起 大多数是由于肺毛细血管壁通透性增加和 或 毛细血管内流体静压升高所致 一 油酸诱发大鼠肺水肿模型 造模原理 可能是由于油酸进入机体后 激活补体 产生C5a 后者趋化炎细胞聚集在肺内 释放自由基 损伤肺毛细血管内皮细胞 使之通透性增加 引起肺水肿 操作方法 体重250g的SD或Wistar大鼠 性别不限 通过静脉缓慢注射油酸0 1ml kg体重 注射油酸后不同时间处死动物 称体重 开胸 结扎气管后取出心肺 分离心脏 称肺重 测量肺系数 二 肾上腺素诱发家兔肺水肿模型 操作方法 家兔2 5 3kg 家兔耳缘静脉缓慢注射0 1 肾上腺素1 0ml kg体重 解剖可见肺脏明显肿大 膨隆 淤血 出血 切面有粉红色泡沫样液体溢出 肺湿重和肺系数可增至正常对照的2 3倍或以上 间质和肺泡内充满富含蛋白的水肿液 肺不张 萎陷 出血 第六节肺纤维化动物模型 肺纤维化 pulmonaryfibrosis 是多种原因引起慢性肺疾病的共同结局 是呼吸衰竭的主要病理基础 其病理改变过程是肺部炎症导致肺泡持续性损伤 经反复破坏 修复 重建 最后引起细胞外基质过度沉积 造模原理 博莱霉素 bleomycin 致肺纤维化的机制迄今未明 可能与自由基损伤 免疫机制和胶原调节失调等有关 其中自由基损伤可能是主要机制 活性氧造成急性肺泡炎 进而发展为肺纤维化 实验动物 体重200g左右的SD或Wistar大鼠 主要试剂 博莱霉素 用生理盐水配成4mg ml溶液 立式照明灯或额戴式喉镜 斜端聚乙烯塑料管 作为气管插管用 操作步骤 1 乙醚麻醉后 仰位以上门齿为悬挂点使大鼠斜挂在60 鼠台上 颈前放置照明灯 2 垫小块纱布将鼠舌拉出 用压舌板压住舌腹 趁动物吸气瞬间迅速将平端聚乙烯塑料管 连1ml注射器 内盛博莱霉素NS溶液 通过声带开口插入气管4 5cm 用棉絮试验导管是否进入气管 确定后缓慢注入博莱霉素溶液 剂量为5mg kg 0 25ml 只 3 注入药物后将动物直立搓动旋转 尽量使药液在肺内分布均匀 4 注入药液后3 7 14和28d处死动物 收集肺标本 部分用于检测肺羟脯氨酸含量等 部分用中性福尔马林固定 常规石蜡切片 HE 苏木精 伊红 和结缔组织染色 结果 注入药液后3d和7d表现为肺明显急性炎症 肺间隔水肿 炎症细胞浸润 以嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞为主 伴有轻度出血 14d肺脏系数 肺重 体重 增加 肺泡壁肺泡巨噬细胞 淋巴细胞等炎症细胞明显减少 成纤维细胞增多 肺泡隔明显增宽 有胶原沉积 呈斑片状纤维化改变 28d时肺组织结构破坏 肺泡腔明显缩小 部分肺泡塌陷或消失 肺间质出现大量胶原纤维和成纤维细胞 形成弥漫性肺纤维化 模型评价 1 博莱霉素是多肽类抗肿瘤药物 单次气管内注入可复制出与人类肺纤维化相似的动物模型 具有操作简便 造模稳定的优点 是目前最常用的肺纤维化动物模型 2 适当掌握麻醉深度 气管插管操作应熟练 否则可能造成咽喉 声带损伤 3 除前述的气管插管外 也可在麻醉下 切开颈前皮肤分离气管 用4号针头在气管环状软骨之间刺入气管内注药 这在小鼠较为常用 也可采用经鼻吸入的方法 4 用博莱霉素也能在仓鼠 小鼠等动物诱发肺纤维化 基本方法与大鼠模型相同 小鼠博莱霉素的用量同大鼠 但也可用2 5mg kg体重 5 也可用6 8周龄雄性ICR小鼠 经鼻滴入博莱霉素3mg kg体重 可制备与气管内直接给药同样的肺纤维化模型 给药2周时出现明显肺纤维化 此方法对动物损伤小 死亡率低 第七节肺结核病动物模型 目前 全球结核病 tuberculosis 疫情呈明显上升趋势 在全球所有传染病中 结核病已成为成年人的首要死因 在我国结核病流行形势也十分严峻 防治任务艰巨 结核结节 一 小鼠模型 实验动物 体重16 20g小鼠 雌雄各半 同批实验体重差别不超过2g 操作步骤 1 临用前 取在改良的罗氏培养基生长2周的强毒人型结核杆菌 H37RV 的表面膜状物 称重 研磨后用NS配制含1 5mg ml 湿重 的菌液 2 给小鼠尾静脉注射上述菌液0 2ml 只 12 29d后可死亡 于感染后第3d开始给予试验药 3 半数死亡时间 T50 一般在14 16d 通常在静脉注射3周后若对照组大部分动物死亡 即可终止实验 剖检脏器 4 观察动物死亡时间或T50 动物生存率 肉眼观察病死和处死动物的肺脏病变面积并分级 测定肺 肝 脾脏的脏器指数 进行脏器的结核杆菌培养 模型评价 1 静脉接种所致急性肺结核是一个适合于药物筛选的模型 不仅对已知药物的反应和临床疗效一致 而且也与其它动物的实验结果一致 2 方法简便 试验时间较短 用药量少 工作量小 3 与大动物相比